Razvoj pristopa hidrolize beljakovin za povečanje prehranskih koristi sveže pripravljenega mesa in rib.
Znanstveni podporni dokument dr. Adriana Hewson-Hughesa | Svetovalec za prehrano, varnost hrane in inovacije, GA Pet Food Partners.
Uvod.
Vsebnost živalskih beljakovin je dobro uveljavljena kot bistvo vrhunske kakovosti hrane za pse in mačke in mnogi lastniki hišnih ljubljenčkov priznavajo, da tukaj velja pregovor "kakovost pred količino". Po podatkih podjetja za tržne raziskave Mintel 59 % lastnikov mačk in 57 % lastnikov psov pravi, da je kakovost mesa pomembnejša od skupne vsebnosti mesa v hrani za hišne ljubljenčke. (MINTEL, 2017).
GA Pet Food Partners je to že dolgo spoznal. Od uvedbe Freshtrusion®, GA je vodilna pri razvoju in izdelavi diet, ki vsebujejo vse večje količine sveže pripravljenega mesa in ribjih virov beljakovin. Prednosti uporabe svežih mesnih in ribjih virov v primerjavi s sušenimi, topljenimi mesnimi in ribjimi obroki, vključno z boljšim okusom in večjo prebavljivostjo, dobro cenijo tako hišni ljubljenčki kot njihovi lastniki.
Prizadevamo si ponuditi našim partnerjem še boljše izdelke.
Trg hrane za hišne živali je zelo dinamičen in čeprav je poudarjanje natančno visokega deleža mesa/rib/perutnine v izdelkih modra poteza, to postaja osnovno pričakovanje lastnikov hišnih ljubljenčkov in ne želena kakovost teh izdelkov. Tukaj v GA nenehno iščemo načine, kako partnerjem ponuditi še boljše izdelke, in zato smo se odločili narediti na videz nemogoče – izumiti način kuhanja naših svežih mesnih in ribjih sestavin, da bodo še boljši za hišne ljubljenčke. .
Ideja je povečati hranilno vrednost beljakovin v naših svežih mesnih in ribjih sestavinah s pretvorbo beljakovin v majhne peptide, ki jih hišni ljubljenčki, ki jih uživajo, lažje absorbirajo (imenujemo jih 'HDP' – visoko prebavljive beljakovine). Da bi nam pomagali pri tem iskanju, smo poiskali strokovnjake na Nofimi, vodilnem raziskovalnem inštitutu za uporabne raziskave hrane s sedežem na Norveškem, da bi optimizirali pogoje za encimsko prebavo izbranih mesnih in ribjih surovin ter jih analizirali, da bi dokazali, da lahko dosežemo, kar želimo .
Prebava beljakovin – proteoliza ali hidroliza
Beljakovine so velike molekule, sestavljene iz posameznih 'gradnikov', imenovanih aminokisline. Po zaužitju hrane, ki vsebuje beljakovine, se začne proces proteolize, ko encimi, ki se sproščajo v različnih delih prebavil, le-te razgradijo na aminokisline in majhne peptide. To omogoča, da se ti gradniki absorbirajo v telo, kjer se lahko ponovno združijo v nove beljakovine (kot so mišice, koža, lasje, protitelesa, encimi, hormoni itd.).
Možno je tudi, da so viri beljakovin podvrženi nadzorovanemu procesu encimske proteolize kot del njihove priprave za vključitev v proizvedena živila in prehranske izdelke. Na primer, beljakovinski hidrolizati se že desetletja uporabljajo v prehrani ljudi, predvsem pri proizvodnji hipoalergenih mlečnih formul za dojenčke/otroke, alergične na beljakovine kravjega mleka.
Encimska ali kemična hidroliza
Hidrolizo beljakovin – pretrganje peptidnih vezi, ki povezujejo aminokisline z dodatkom vode – je mogoče doseči z različnimi metodami: kemično z uporabo kislin ali baz (alkalno) ali encimsko (pristop, na katerega se osredotočamo). Medtem ko metode kisle in alkalne hidrolize beljakovin ponujajo prednost nizkih stroškov, obstajajo negativne posledice v smislu prehranske kakovosti proizvedenih hidrolizatov. Kislinska hidroliza povzroči popolno uničenje esencialne aminokisline triptofan ter delno izgubo metionina, cistina in cisteina. (Pasupuleki in Braun, 2010). Podobno alkalna hidroliza povzroči popolno uničenje večine aminokislin, čeprav lahko triptofan preživi nedotaknjen (Dai, et al., 2014) (Hou, et al., 2017).
V primerjavi s kislo in alkalno hidrolizo so glavne prednosti encimske hidrolize beljakovin:
- Pogoji hidrolize, kot sta temperatura in pH, so blagi in ne povzročijo znane izgube aminokislin.
- Uporaba encimov proteaze je bolj specifična in natančna pri nadzoru obsega hidrolize in velikosti peptidov.
- Majhne količine uporabljenega encima je mogoče enostavno deaktivirati (npr. s segrevanjem na 80 – 85 °C za vsaj 3 minute), da zaustavite reakcijo hidrolize. (Hou, et al., 2017).
Prehranske prednosti encimsko hidroliziranih beljakovin: prebavljivost in absorpcija beljakovin.
Poleg uporabljene metode hidrolize beljakovin, kot je bilo opisano prej, je hranilna vrednost beljakovinskih hidrolizatov odvisna od prisotnih sestave prostih aminokislin, majhnih peptidov (običajno di- in tri-peptidov) in velikih peptidov. Zgodovinsko gledano je veljalo, da so samo proste aminokisline absorbirane iz prebavil s posebnimi prenašalci aminokislin. To se res zgodi, vendar je zdaj priznano, da se večina aminokislin absorbira kot di- in tri-peptidi s širokospecifičnim peptidnim prenašalcem PepT1 (Fej, et al., 1994). PepT1 lahko potencialno prenaša vseh 400 di-peptidov in 8,000 tri-peptidov, ki nastanejo pri kombinaciji 20 različnih prehranskih aminokislin (Daniel, 2004). Zato bi pričakovali, da bi zaužitje beljakovinskega hidrolizata, ki vsebuje visoke deleže di- in tri-peptidov, olajšalo prebavo in absorpcijo beljakovin, kar bi povečalo prebavljivost in biološko uporabnost aminokislin.
Jasno je, da je vzpostavitev najboljših encimskih in hidroliznih pogojev ključnega pomena za ustvarjanje beljakovinskih hidrolizatov z želenimi končnimi profili velikosti peptidov. Porazdelitev velikosti peptidov je mogoče določiti s tehniko, imenovano kromatografija izključitve velikosti. Velikostno izključitvena kromatografija (SEC) je tehnika analitične kemije, pri kateri so mešanice molekul (kot so proteini ali peptidi), raztopljene v raztopini, ločene po velikosti (kot je prikazano na sliki 1).
SLIKA 1. Enostaven pregled ločevanja molekul različnih velikosti v raztopini z izključitveno kromatografijo (SEC). Raztopino nanesemo na kolono, ki je napolnjena s smolo poroznih sferičnih kroglic (sive kroglice). Velike molekule (rdeči krogi) ne bodo mogle vstopiti v pore (luknje) kroglic in bodo zato razmeroma hitro prešle navzdol po koloni in bodo prve zaznane. Manjše molekule v vzorcu lahko vstopajo v pore v različni meri, odvisno od njihove velikosti. 'Srednje velike' molekule (zeleni krogi) bodo lahko vstopile v nekatere kroglice, v druge pa ne, zato bodo potrebovale več časa, da preidejo skozi kolono, medtem ko bodo najmanjše molekule (modri krogi) lahko vstopile v vse pore in bodo trajale najdlje skozi kolono.
Metode
surovine – Svežim vzorcem trupov piščanca, račjih trupov in okvirjev lososa smo zmanjšali velikost, jih homogenizirali v gosto pasto in zamrznili. Sveža jagnječja jetra so bila cela zamrznjena. Gradivo je bilo poslano na Nofima, Ås, Norveška, za proteolizo in analizo.
Proteoliza – Za vsako surovino (piščanec, raca, losos in jagnjetina) smo 500 g vzorca zmešali z 990 ml destilirane vode v stekleni reakcijski posodi in mešali pri 300 obratih na minuto. Za vsako surovino so bili testirani trije različni encimi proteaze pri dveh različnih koncentracijah in dveh časovnih točkah, kar je povzročilo 48 vzorcev hidrolizata za analizo.
Velikostna izključitvena kromatografija – Porazdelitev molekulske mase vodotopne beljakovinske frakcije hidrolizatov je bila določena s kromatografijo za izločitev velikosti z uporabo sistema za tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC) Shimadzu LC-20AT z detektorjem niza fotodiod (SPD M20A), nastavljenim na 214 nm.
Vsebnost kolagenskih peptidov – Hidroksiprolin je modificirana aminokislina, katere prisotnost je v glavnem omejena na kolagen. Vsebnost hidroksiprolina v beljakovinskih hidrolizatih se lahko uporablja kot posredno merilo količine prisotnega kolagena/kolagenskih peptidov. Nofima Biolab je opravil popolno analizo aminokislin (vključno s hidroksiprolinom) vsake surovine; poleg tega smo v akreditiranem laboratoriju (ALS, Norveška) določili vsebnost hidroksiprolina v vodotopni frakciji hidrolizatov.
Rezultati
Porazdelitev velikosti peptidov v hidrolizatih – Na splošno je za vsak testirani encim inkubacija vsake surovine z višjo koncentracijo encima in dlje časa povzročila "koristno" spremembo v profilu velikosti peptidov hidrolizatov (tj. povečanje deleža manjših peptidov ). To je poudarjeno na sliki 2, ki prikazuje rezultate za vsako surovino z uporabo "najboljšega" encima pri "neoptimalni" koncentraciji in trajanju v primerjavi z "optimalno" koncentracijo in trajanjem. Z optimiziranimi pogoji smo ugotovili, da je bilo 100 % peptidov ≤3 kDa, več kot 75 % pa < 0.5 kDa (slika 2).
Na podlagi skupnih dokazov več študij na številnih vrstah (npr. podgana, prašič, pes, človek; glejte (Zhangi & Matthews, 2010) za pregled je na splošno dobro sprejeto, da:
- Absorpcija peptidov je boljša v primerjavi z intaktnimi beljakovinami.
- Absorpcija peptidov je boljša od absorpcije prostih aminokislin.
- Absorpcija majhnih peptidov je boljša kot velikih peptidov.
Fiziološko se večina aminokislin absorbira kot majhni peptidi, sestavljeni iz 2 ali 3 aminokislin, povezanih skupaj (di- oziroma tri-peptidi). Zato bi pričakovali, da bi zaužitje beljakovinskega hidrolizata, ki vsebuje visoke deleže di- in tri-peptidov, olajšalo prebavo in absorpcijo beljakovin, kar bi povečalo prebavljivost in biološko uporabnost aminokislin. Povprečna molekulska masa aminokisline je 110 Daltonov (Da), tako da bi imeli di- in tri-peptidi molekulsko maso približno 220-330 Da (0.2-0.3 kDa). Naši rezultati pri doseganju beljakovinskih hidrolizatov z več kot 75 % peptidov, manjših od 0.5 kDa (tj. do ~ 5 aminokislin), pomenijo, da bi bile beljakovine v naših drobtinah zelo prebavljive in bi jih hišni ljubljenčki zlahka absorbirali. To je načrtovano dokazati s študijo o krmljenju v sodelovanju s Fakulteto za veterinarsko medicino Univerze v Gentu.
Poleg tega doseganje 100 % peptidov 3 kDa ali manj zmanjša tveganje za sprožitev alergijske reakcije na vire beljakovin in se zato lahko šteje za hipoalergeno.
Slika 2.
Porazdelitev velikosti (kDa) peptidov v vodni fazi hidrolizatov vsake surovine, inkubirane z istim encimom pod „neoptimiziranimi“ in „optimiziranimi“ pogoji v smislu koncentracije encima in trajanja hidrolize. Upoštevajte zlasti, kako se odstotek peptidov med 1.0–3.0 kDa zmanjša in peptidov <0.5 kDa poveča, pri čemer se pomaknete iz „neoptimiziranih“ v „optimizirane“ pogoje.
Vsebnost kolagenskih peptidov
Za vsako testirano surovino sta se encima A in C na splošno izkazala 'bolje' (v smislu rekuperacije večjega odstotka hidroksiprolina v vodni fazi hidrolizatov) kot encim B, če primerjamo dano trajanje hidrolize in koncentracijo encima (npr. glej rezultati za lososa na sliki 3).
Ker 'neokrnjeni' kolagenski protein ni topen v vodi, prisotnost hidroksiprolina (našega označevalca 'kolagena') v vodni fazi kaže, da je bil kolagenski protein prebavljen v kolagenske peptide (ki so vodotopni). Naši rezultati kažejo, da lahko uporabimo encimsko proteolizo za ustvarjanje surovin, ki lahko prinesejo potencialne funkcionalne koristi, kot je podpora zdravju sklepov, zdravju kože in zdravju črevesja s pomočjo kolagenskih peptidov, ki so v njih prisotni.
SLIKA 3. Odstotek hidroksiprolina (aminokisline, ki je skoraj izključno v kolagenu), pridobljenega v vodni fazi hidroliziranega lososa s tremi različnimi encimi (A, B ali C), inkubiranega s surovino (losos) pri dveh različnih koncentracijah (C1 ali C2) za dve različni časovni obdobji (T1 ali T2).
zaključek
Ti pozitivni rezultati predstavljajo priložnosti za pridobivanje dodatne vrednosti naravne prisotnosti kolagena v določenih surovinah z ustvarjanjem kolagenskih peptidov s potencialom zagotavljanja funkcionalnih koristi, kot je ohranjanje zdravih sklepov pri aktivnih hišnih ljubljenčkih ter izboljšanje gibljivosti in prožnosti sklepov pri starejših hišnih ljubljenčkih, za primer.
Z visokim odstotkom (>75 %) majhnih peptidov (<0.5 kDa), proizvedenih v "optimiziranih" pogojih na podlagi te raziskave, je prvi del našega HDP cilj dosežen. Naslednji pomemben korak je dokazati, da so kruhki, narejeni s tem HDP, res bolj prebavljivi in biološko razpoložljivi kot naši obstoječi sveže pripravljeni izdelki – to delamo v študiji hranjenja z Univerza v Gentu Veterinarska šola. Pazi na ta prostor!
Reference
- Cave, N., 2006. Hidrolizirane beljakovinske diete za pse in mačke. Veterinary Clinics Small Animal Practice, zvezek 36, str. 1251-1268.
- Dai, Z., Wu, Z., Jia, S. & Wu, G., 2014. Analiza aminokislinske sestave v beljakovinah živalskih tkiv in živil kot derivatov o-ftaldialdehida pred kolono s HPLC s fluorescenčno detekcijo. J Kromatografija B, zvezek 964, str. 116-127.
- Daniel, H., 2004. Molekularna in integrativna fiziologija transporta črevesnih peptidov. Letni pregled fiziologije, zvezek 66, str. 361-384.
- Fei, Y. et al., 1994. Ekspresijsko kloniranje protonsko sklopljenega oligopeptidnega transporterja sesalcev. Nature, zvezek 7, str. 563-566.
- Hanaoka, K. et al., 2019. Karakterizacija molekulske mase beljakovin in peptidov med proizvodnjo okusov hrane za hišne živali. [Na spletu] Dostopno na: https://www.diana-petfood.com/emea-en/publications/
- Hou, Y. et al., 2017. Proteinski hidrozati v prehrani živali: industrijska proizvodnja, bioaktivni peptidi in funkcionalni pomen. Journal of Animal Science and Biotechnology, str. 24-36.
- Knights, R., 1985. Predelava in vrednotenje beljakovinskih hidrolizatov. V: Prehrana za posebne potrebe. New York: Marcel Dekker, str. 105-115.
- MINTEL, 2017. Večja preglednost glede beljakovin v hrani za hišne živali, sl: MINTEL REPORTS.
- Pasupuleki, VK, Braun, S, 2010. Najsodobnejša proizvodnja beljakovinskih hidrolizatov. V: Proteinski hidrolizati v biotehnologiji. New York: Springer, str. 11-32.
- Zhangi, B. & Matthews, J., 2010. Fiziološki pomen in mehanizmi absorpcije beljakovinskega hidrolizata. V: Proteinski hidrolizati v biotehnologiji. New York: Springer, str. 135-177.