Utveckling av proteinhydrolysmetoden för att öka de näringsmässiga fördelarna med nylagat kött och fisk.
Ett vetenskapligt stöddokument av Dr Adrian Hewson-Hughes | Nutrition, Food Safety & Innovation Advisor, GA Pet Food Partners.
Inledning.
Innehållet av animaliskt protein är väl etablerat som essensen av foder av högsta kvalitet för hundar och katter, och många husdjursägare inser att ordspråket "kvalitet framför kvantitet" gäller här. Enligt marknadsundersökningsföretaget Mintel säger 59 % av kattägarna och 57 % av hundägarna att köttets kvalitet är viktigare än den totala kötthalten i sällskapsdjursfoder (MINTEL, 2017).
GA Pet Food Partners har länge insett detta. Sedan införandet av Freshtrusion®, GA har lett vägen för att utveckla och tillverka dieter som innehåller ökande mängder nylagat kött och fiskproteinkällor. Fördelarna med att använda färska kött- och fiskkällor framför torkade, utsmälta kött- och fiskmåltider, inklusive bättre smak och ökad smältbarhet, uppskattas väl av både husdjur och deras ägare.
Strävar efter att erbjuda våra partners ännu bättre produkter.
Djurfodermarknaden är mycket dynamisk och även om det är ett klokt drag att lyfta fram den exakta höga andelen kött/fisk/fågel i produkter, blir detta en basförväntning snarare än den önskade kvaliteten för dessa produkter från djurägare. Här på GA strävar vi ständigt efter sätt att erbjuda Partners ännu bättre produkter, och det är därför vi siktar på att göra det till synes omöjliga – komma på ett sätt att tillaga våra färska kött- och fiskingredienser för att göra dem ännu bättre för husdjur .
Tanken är att öka näringsvärdet av proteinet i våra färska kött- och fiskingredienser genom att omvandla proteinet till små peptider, som lättare absorberas av husdjuren som äter det (vi kallar det 'HDP' – Highly Digestible Protein). För att hjälpa oss i denna strävan identifierade vi experter på Nofima, ett ledande forskningsinstitut för tillämpad livsmedelsforskning baserat i Norge, för att optimera förutsättningarna för enzymatisk nedbrytning av utvalda kött- och fiskråvaror och analysera dem för att visa att vi kunde uppnå det vi ville. .
Protein Digestion - aka Proteolysis eller Hydrolysis
Proteiner är stora molekyler som består av individuella "byggstenar" som kallas aminosyror. Efter att ha ätit mat som innehåller protein börjar processen med proteolys när enzymer som frigörs i olika delar av mag-tarmkanalen bryter ner det till aminosyror och små peptider. Detta gör att dessa byggstenar kan tas upp i kroppen, där de kan kombineras för att bygga nya proteiner (som muskler, hud, hår, antikroppar, enzymer, hormoner, etc.).
Det är också möjligt för proteinkällor att genomgå en kontrollerad enzymatisk proteolysprocess som en del av deras förberedelse för inkludering i tillverkade livsmedel och näringsprodukter. Till exempel har proteinhydrolysat använts i decennier i mänsklig näring, framför allt i produktionen av hypoallergena modersmjölksersättningar för spädbarn/barn som är allergiska mot komjölksprotein.
Enzymatisk eller kemisk hydrolys
Proteinhydrolys – brytningen av peptidbindningar som binder samman aminosyror genom tillsats av vatten – kan uppnås med olika metoder: kemiskt med syror eller baser (alkaliska) eller enzymatiskt (det tillvägagångssätt vi fokuserar på). Medan metoderna för sur och alkalisk hydrolys av proteiner erbjuder fördelen med låg kostnad, finns det negativa konsekvenser när det gäller näringskvaliteten hos de producerade hydrolysaterna. Syrahydrolys resulterar i fullständig förstörelse av den essentiella aminosyran tryptofan, såväl som partiell förlust av metionin, cystin och cystein (Pasupuleki & Braun, 2010). På liknande sätt resulterar alkalisk hydrolys i fullständig förstörelse av de flesta aminosyror, även om tryptofan kan överleva intakt (Dai, et al., 2014) (Hou, et al., 2017).
Jämfört med sur och alkalisk hydrolys är de viktigaste fördelarna med enzymatisk hydrolys av proteiner:
- Hydrolysförhållandena såsom temperatur och pH är milda och resulterar inte i någon känd förlust av aminosyror.
- Användningen av proteasenzym(er) är mer specifik och exakt för att kontrollera omfattningen av hydrolys och storleken på peptider.
- De små mängderna enzym som används kan enkelt deaktiveras (t.ex. upphettning till 80 – 85ºC i minst 3 minuter) för att stoppa hydrolysreaktionen. (Hou, et al., 2017).
Näringsfördelar med enzymatiskt hydrolyserat protein: proteinsmältbarhet och absorption.
Förutom metoden för proteinhydrolys som används, som beskrivits tidigare, beror näringsvärdet hos proteinhydrolysat på sammansättningen av fria aminosyror, små peptider (typiskt di- och tripeptider) och stora peptider som finns närvarande. Historiskt trodde man att endast fria aminosyror absorberades från mag-tarmkanalen av specifika aminosyratransportörer. Detta inträffar, men det är nu känt att majoriteten av aminosyrorna absorberas som di- och tripeptider av den bredspecifika peptidtransportören PepT1 (Fei, et al., 1994). PepT1 kan potentiellt transportera alla 400 di-peptider och 8,000 20 tri-peptider som är resultatet av att kombinera de XNUMX olika dietaminosyrorna (Daniel, 2004). Därför skulle det förväntas att intag av ett proteinhydrolysat som innehåller höga andelar di- och tripeptider skulle underlätta proteinsmältning och absorption, vilket resulterar i ökad smältbarhet och aminosyrabiotillgänglighet.
Det är uppenbart att fastställa de bästa enzym- och hydrolysförhållandena är avgörande för att kunna skapa proteinhydrolysat med de önskade slutliga peptidstorleksprofilerna. Peptidstorleksfördelning kan bestämmas med hjälp av en teknik som kallas storleksexklusionskromatografi. Storleksexklusionskromatografi (SEC) är en analytisk kemiteknik där blandningar av molekyler (såsom proteiner eller peptider) lösta i en lösning separeras av deras storlek (som beskrivs i figur 1).
FIGUR 1. Enkel översikt över separationen av molekyler av olika storlekar i en lösning genom storleksexklusionskromatografi (SEC). Lösningen appliceras på en kolonn som är packad med ett harts av porösa sfäriska pärlor (grå sfärer). Stora molekyler (röda cirklar) kommer inte att kunna tränga in i pärlornas porer (hål) och passerar därför relativt snabbt ner i kolonnen och kommer att detekteras först. Mindre molekyler i provet kan komma in i porerna i varierande grad beroende på deras storlek. "Medelstora" molekyler (gröna cirklar) kommer att kunna komma in i vissa pärlor men inte andra och kommer därför att ta längre tid att passera genom kolonnen, medan de minsta molekylerna (blå cirklar) kommer att kunna komma in i alla porer och kommer att ta den längsta att passera genom kolonnen.
Metoder
Råvaror – Färska prover av kycklingkroppar, ankkroppar och laxramar storleksminskades, homogeniserades till en tjock pasta och frystes. Färsk lammlever frystes hel. Materialet skickades till Nofima, Ås, Norge, för proteolys och analys.
Proteolys – För varje råvara (kyckling, anka, lax och lamm) blandades ett 500 g prov med 990 ml destillerat vatten i ett reaktionskärl av glas och omrördes vid 300 rpm. För varje råmaterial testades tre olika proteasenzymer vid två olika koncentrationer och två tidpunkter, vilket resulterade i 48 hydrolysatprover för analys.
Storleksuteslutningskromatografi – Molekylviktsfördelningen för den vattenlösliga proteinfraktionen i hydrolysaten bestämdes genom storleksuteslutningskromatografi med användning av ett Shimadzu LC-20AT högpresterande vätskekromatografi (HPLC)-system med en fotodiodmatrisdetektor (SPD M20A) inställd på 214nm.
Kollagenpeptidinnehåll – Hydroxyprolin är en modifierad aminosyra, vars närvaro huvudsakligen är begränsad till kollagen. Hydroxiprolinhalten i proteinhydrolysat kan användas som ett indirekt mått på mängden närvarande kollagen/kollagenpeptider. En fullständig aminosyraanalys (inklusive hydroxiprolin) av varje råmaterial utfördes av Nofima Biolab; dessutom bestämdes hydroxiprolinhalten vid ett ackrediterat laboratorium (ALS, Norge) i den vattenlösliga fraktionen av hydrolysaten.
Resultat
Peptidstorleksfördelning av hydrolysat – Generellt sett, för varje testat enzym, resulterade inkubation av varje råmaterial med den högre koncentrationen av enzym och under en längre varaktighet i en "gynnsam" förändring av hydrolysatens peptidstorleksprofil (dvs. en ökning av andelen mindre peptider) ). Detta framhävs i figur 2, som visar resultat för varje råmaterial med det "bästa" enzymet vid "icke-optimal" koncentration och varaktighet jämfört med "optimal" koncentration och varaktighet. Med optimerade förhållanden fann vi att 100 % av peptiderna var ≤3 kDa och mer än 75 % var <0.5 kDa (Figur 2).
Baserat på de samlade bevisen från flera studier på ett antal arter (t.ex. råtta, gris, hund, människa; se (Zhangi & Matthews, 2010) för en översikt är det allmänt accepterat att:
- Absorption av peptider är bättre jämfört med intakt protein.
- Absorption av peptider är bättre än fria aminosyror.
- Absorption av små peptider är bättre än av stora peptider.
Fysiologiskt absorberas majoriteten av aminosyrorna som små peptider som består av 2 eller 3 aminosyror sammanfogade (di- respektive tri-peptider). Därför skulle det förväntas att intag av ett proteinhydrolysat som innehåller höga andelar di- och tripeptider skulle underlätta proteinsmältning och absorption, vilket resulterar i ökad smältbarhet och aminosyrabiotillgänglighet. Medelmolekylvikten för en aminosyra är 110 Dalton (Da), så di- och tripeptider skulle ha en molekylvikt på ungefär 220-330 Da (0.2-0.3 kDa). Våra resultat för att uppnå proteinhydrolysat med mer än 75 % av peptiderna mindre än 0.5 kDa (dvs. upp till ~ 5 aminosyror) betyder att proteinet i våra småbitar skulle vara lättsmälta och lätt absorberas av husdjuren som äter det. Det är planerat att demonstrera detta genom en utfodringsstudie i samarbete med Fakulteten för veterinärmedicin, universitetet i Gent.
Att uppnå 100 % av peptiderna på 3 kDa eller mindre minskar dessutom risken för att utlösa en allergisk reaktion mot proteinkällorna och kan därför betraktas som hypoallergen.
Figur 2.
Storleksfördelning (kDa) av peptider i vattenfasen av hydrolysat av varje råmaterial inkuberat med samma enzym under "icke-optimerade" och "optimerade" förhållanden vad gäller enzymkoncentration och hydrolysens varaktighet. Notera särskilt hur andelen peptider mellan 1.0-3.0 kDa minskar och peptider <0.5 kDa ökar, och går från "icke-optimerade" till "optimerade" förhållanden.
Kollagenpeptidinnehåll
För varje testat råmaterial presterade enzym A och C generellt "bättre" (när det gäller att återvinna en större andel hydroxiprolin i hydrolysatens vattenfas) än enzym B när man jämför en given hydrolysvaraktighet och enzymkoncentration (se t.ex. resultat för lax i figur 3).
Eftersom "intakt" kollagenprotein inte är lösligt i vatten, indikerar närvaron av hydroxiprolin (vår markör för "kollagen") i vattenfasen att kollagenproteinet har smält till kollagenpeptider (som är vattenlösliga). Våra resultat visar att vi kan använda enzymatisk proteolys för att skapa råvaror som kan ge potentiella funktionella fördelar som att stödja ledhälsa, hudhälsa och tarmhälsa genom de kollagenpeptider som finns i dem.
BILD 3. Andel hydroxyprolin (en aminosyra som nästan uteslutande finns i kollagen) som återvinns i vattenfasen hos hydrolyserad lax med tre olika enzymer (A, B eller C) inkuberade med råvaran (lax) i två olika koncentrationer (C1 eller C2) för två olika tidsperioder (T1 eller T2).
Slutsats
Dessa positiva resultat ger möjligheter att få extra värde från den naturliga närvaron av kollagen i vissa råvaror genom att skapa kollagenpeptider med potential att leverera funktionella fördelar som att bibehålla friska leder hos aktiva husdjur och förbättra rörlighet och flexibilitet hos leder hos äldre husdjur, för exempel.
Med den höga andelen (>75 %) små peptider (<0.5 kDa) producerade under "optimerade" förhållanden baserat på denna forskning, är den första delen av vår HDP målet är uppnått. Nästa viktiga steg är att visa att kibble gjorda med denna HDP verkligen är mer smältbara och biotillgängliga än våra befintliga nyberedda produkter – vi är upptagna med att utföra detta i en utfodringsstudie med University of Gent Veterinärskola. Övervaka den här ytan!
Referensprojekt
- Cave, N., 2006. Hydrolyserad proteindiet för hundar och katter. Veterinary Clinics Small Animal Practice, volym 36, s. 1251-1268.
- Dai, Z., Wu, Z., Jia, S. & Wu, G., 2014. Analys av aminosyrasammansättning i proteiner från animaliska vävnader och livsmedel som o-ftaldialdehydderivat från förkolumnen genom HPLC med fluorescensdetektion. J Chromatography B, volym 964, sid. 116-127.
- Daniel, H., 2004. Molecular and integrative physiology of intestinal peptide transport.. Annual Review of Physiology, Volym 66, s. 361-384.
- Fei, Y. et al., 1994. Expressionskloning av en däggdjursprotonkopplad oligopeptidtransportör. Nature, volym 7, sid. 563-566.
- Hanaoka, K. et al., 2019. Karakterisering av proteiner och peptiders molekylvikt under tillverkning av sällskapsdjursmat. [Online] Tillgänglig på: https://www.diana-petfood.com/emea-en/publications/
- Hou, Y. et al., 2017. Proteinhydroysater i djurfoder: Industriell produktion, bioaktiva peptider och funktionell betydelse. Journal of Animal Science and Biotechnology, s. 24-36.
- Knights, R., 1985. Bearbetning och utvärdering av proteinhydrolysat. I: Nutrition for Special Needs. New York: Marcel Dekker, s. 105-115.
- MINTEL, 2017. Större transparens vad gäller protein i djurfoder, sl: MINTEL RAPPORTER.
- Pasupuleki, VK, Braun, S, 2010. Toppmodern tillverkning av proteinhydrolysat. I: Protein Hydrolysates in Biotechnology. New York: Springer, s. 11-32.
- Zhangi, B. & Matthews, J., 2010. Fysiologisk betydelse och mekanismer för proteinhydrolysatabsorption. I: Protein Hydrolysates in Biotechnology. New York: Springer, s. 135-177.