Vývoj prístupu proteínovej hydrolýzy na zvýšenie nutričných výhod čerstvo pripraveného mäsa a rýb.
Vedecký podporný dokument Dr. Adriana Hewsona-Hughesa | poradca pre výživu, bezpečnosť potravín a inovácie, GA Pet Food Partners.
Úvod.
Obsah živočíšnych bielkovín je dobre známy ako základ prémiových krmív pre psov a mačky a mnohí majitelia domácich zvierat uznávajú, že tu platí pravidlo „kvalita pred kvantitou“. Podľa prieskumu trhu spoločnosti Mintel 59 % majiteľov mačiek a 57 % majiteľov psov tvrdí, že kvalita mäsa je dôležitejšia ako celkový obsah mäsa v krmive pre domáce zvieratá. (MINTEL, 2017).
GA Pet Food Partners to už dávno uznáva. Od zavedenia Freshtrusion®, GA je lídrom vo vývoji a výrobe diét obsahujúcich stále väčšie množstvo čerstvo pripravených zdrojov bielkovín z mäsa a rýb. Domáce zvieratá aj ich majitelia dobre ocenia výhody používania zdrojov čerstvého mäsa a rýb pred sušenými, tavenými mäsovými a rybími jedlami, vrátane lepšej chuti a zvýšenej stráviteľnosti.
Snažíme sa našim partnerom ponúkať ešte lepšie produkty.
Trh s krmivami pre domáce zvieratá je veľmi dynamický a hoci zdôrazňovanie presného vysokého podielu mäsa/ryb/hydiny vo výrobkoch je múdrym krokom, stáva sa to skôr základným očakávaním než želanou kvalitou týchto výrobkov od majiteľov domácich zvierat. Tu v GA neustále hľadáme spôsoby, ako ponúknuť Partners ešte lepšie produkty, a preto sme sa rozhodli urobiť zdanlivo nemožné – prísť na spôsob, ako variť naše čerstvé mäsové a rybie ingrediencie, aby boli pre domácich miláčikov ešte lepšie. .
Cieľom je zvýšiť nutričnú hodnotu bielkovín v našich zložkách z čerstvého mäsa a rýb premenou bielkovín na malé peptidy, ktoré sú ľahšie absorbované domácimi zvieratami, ktoré ich jedia (nazývame to „HDP“ – vysoko stráviteľný proteín). Aby nám pomohli v tomto hľadaní, identifikovali sme odborníkov v Nofime, poprednom výskumnom ústave pre aplikovaný výskum potravín so sídlom v Nórsku, aby optimalizovali podmienky pre enzymatické trávenie vybraných mäsových a rybích surovín a analyzovali ich, aby sme dokázali, že dokážeme dosiahnuť to, čo sme chceli. .
Trávenie bielkovín – aka proteolýza alebo hydrolýza
Proteíny sú veľké molekuly zložené z jednotlivých „stavebných blokov“ nazývaných aminokyseliny. Po zjedení potravy obsahujúcej bielkoviny sa začína proces proteolýzy, pretože enzýmy uvoľnené v rôznych častiach gastrointestinálneho traktu ich rozkladajú na aminokyseliny a malé peptidy. To umožňuje, aby sa tieto stavebné bloky vstrebali do tela, kde sa môžu rekombinovať na vytvorenie nových proteínov (ako sú svaly, koža, vlasy, protilátky, enzýmy, hormóny atď.).
Je tiež možné, že zdroje bielkovín podstúpia proces riadenej enzymatickej proteolýzy ako súčasť ich prípravy na zahrnutie do vyrábaných potravín a výživových produktov. Napríklad bielkovinové hydrolyzáty sa už desaťročia používajú v ľudskej výžive, najmä pri výrobe hypoalergénnej dojčenskej mliečnej výživy pre dojčatá/deti alergické na bielkovinu kravského mlieka.
Enzymatická alebo chemická hydrolýza
Hydrolýzu bielkovín – rozbitie peptidových väzieb, ktoré spájajú aminokyseliny dohromady pridaním vody – možno dosiahnuť rôznymi spôsobmi: chemicky pomocou kyselín alebo zásad (alkalické) alebo enzymaticky (prístup, na ktorý sa zameriavame). Zatiaľ čo metódy kyslej a alkalickej hydrolýzy proteínov ponúkajú výhodu nízkej ceny, existujú negatívne dôsledky z hľadiska nutričnej kvality vyrobených hydrolyzátov. Kyslá hydrolýza vedie k úplnému zničeniu esenciálnej aminokyseliny tryptofánu, ako aj k čiastočnej strate metionínu, cystínu a cysteínu (Pasupuleki & Braun, 2010). Podobne alkalická hydrolýza vedie k úplnému zničeniu väčšiny aminokyselín, hoci tryptofán môže prežiť neporušený (Dai, et al., 2014), (Hou, et al., 2017).
V porovnaní s kyslou a alkalickou hydrolýzou sú hlavné výhody enzymatickej hydrolýzy bielkovín:
- Podmienky hydrolýzy, ako je teplota a pH, sú mierne a nevedú k žiadnej známej strate aminokyselín.
- Použitie proteázového enzýmu (enzýmov) je špecifickejšie a presnejšie pri kontrole rozsahu hydrolýzy a veľkosti peptidov.
- Malé množstvá použitého enzýmu možno ľahko deaktivovať (napr. zahriatím na 80 – 85ºC po dobu aspoň 3 minút), aby sa zastavila hydrolytická reakcia. (Hou, et al., 2017).
Nutričné výhody enzymaticky hydrolyzovaného proteínu: stráviteľnosť a vstrebávanie bielkovín.
Okrem použitej metódy hydrolýzy proteínov, ako bolo uvedené vyššie, nutričná hodnota proteínových hydrolyzátov závisí od zloženia prítomných voľných aminokyselín, malých peptidov (typicky di- a tripeptidov) a veľkých peptidov. Historicky sa verilo, že iba voľné aminokyseliny boli absorbované z gastrointestinálneho traktu špecifickými transportérmi aminokyselín. To sa stáva, ale teraz sa uznáva, že väčšina aminokyselín je absorbovaná ako di- a tri-peptidy široko-špecifickým peptidovým transportérom PepT1 (Fei, et al., 1994). PepT1 môže potenciálne transportovať všetkých 400 dipeptidov a 8,000 20 tripeptidov, ktoré sú výsledkom kombinácie XNUMX rôznych diétnych aminokyselín (Daniel, 2004). Preto by sa dalo očakávať, že požitie proteínového hydrolyzátu obsahujúceho vysoké podiely di- a tripeptidov uľahčí trávenie a absorpciu proteínu, čo vedie k zvýšenej stráviteľnosti a biologickej dostupnosti aminokyselín.
Je jasné, že stanovenie najlepších podmienok pre enzým a hydrolýzu je rozhodujúce, aby bolo možné vytvoriť hydrolyzáty proteínov s požadovanými profilmi konečnej veľkosti peptidov. Distribúciu veľkosti peptidov možno určiť pomocou techniky nazývanej vylučovacia chromatografia. Veľkostne vylučovacia chromatografia (SEC) je analytická chemická technika, pri ktorej sa zmesi molekúl (ako sú proteíny alebo peptidy) rozpustené v roztoku oddeľujú podľa ich veľkosti (ako je znázornené na obrázku 1).
OBRÁZOK 1. Jednoduchý prehľad separácie molekúl rôznych veľkostí v roztoku vylučovacou chromatografiou (SEC). Roztok sa nanesie na kolónu, ktorá je naplnená živicou z poréznych guľôčkových guľôčok (sivé guľôčky). Veľké molekuly (červené kruhy) nebudú môcť vstúpiť do pórov (dier) guľôčok, a preto prejdú stĺpcom relatívne rýchlo a budú detekované ako prvé. Menšie molekuly vo vzorke môžu vstúpiť do pórov v rôznej miere v závislosti od ich veľkosti. „Stredne veľké“ molekuly (zelené krúžky) budú môcť vstúpiť do niektorých guľôčok, ale nie do iných, a preto bude prechod cez stĺpec trvať dlhšie, zatiaľ čo najmenšie molekuly (modré krúžky) budú môcť vstúpiť do všetkých pórov a najdlhšie prejde kolónou.
Metódy
suroviny – Čerstvé vzorky jatočných tiel kurčiat, jatočných tiel kačiek a lososových rámov boli zmenšené, homogenizované na hustú pastu a zmrazené. Čerstvá jahňacia pečeň bola zmrazená celá. Materiály boli zaslané na Nofima, Ås, Nórsko, na proteolýzu a analýzu.
Proteolýza – Pre každú surovinu (kuracie, kačacie, lososové a jahňacie) sa 500 g vzorka zmiešala s 990 ml destilovanej vody v sklenenej reakčnej nádobe a miešala pri 300 ot./min. Pre každú surovinu boli testované tri rôzne proteázové enzýmy v dvoch rôznych koncentráciách a dvoch časových bodoch, výsledkom čoho bolo 48 vzoriek hydrolyzátu na analýzu.
Veľkostná vylučovacia chromatografia – Distribúcia molekulovej hmotnosti vo vode rozpustnej proteínovej frakcie hydrolyzátov bola stanovená vylučovacou chromatografiou s použitím systému vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC) Shimadzu LC-20AT s detektorom fotodiódového poľa (SPD M20A) nastaveným na 214 nm.
Obsah kolagénových peptidov – Hydroxyprolín je modifikovaná aminokyselina, ktorej prítomnosť je obmedzená hlavne na kolagén. Obsah hydroxyprolínu v proteínových hydrolyzátoch sa môže použiť ako nepriama miera množstva prítomných kolagénových/kolagénových peptidov. Kompletnú analýzu aminokyselín (vrátane hydroxyprolínu) každého surového materiálu vykonala spoločnosť Nofima Biolab; okrem toho bol v akreditovanom laboratóriu (ALS, Nórsko) vo vode rozpustnej frakcii hydrolyzátov stanovený obsah hydroxyprolínu.
výsledky
Distribúcia veľkosti peptidov hydrolyzátov – Vo všeobecnosti pre každý testovaný enzým viedla inkubácia každej suroviny s vyššou koncentráciou enzýmu a dlhšie trvanie k „výhodnému“ posunu v profile veľkosti peptidov hydrolyzátov (tj k zvýšeniu podielu menších peptidov ). Toto je zvýraznené na obrázku 2, ktorý ukazuje výsledky pre každú surovinu s použitím „najlepšieho“ enzýmu pri „neoptimálnej“ koncentrácii a trvaní v porovnaní s „optimálnou“ koncentráciou a trvaním. Pri optimalizovaných podmienkach sme zistili, že 100 % peptidov malo ≤ 3 kDa a viac ako 75 % malo < 0.5 kDa (obrázok 2).
Na základe súhrnných dôkazov niekoľkých štúdií na mnohých druhoch (napr. potkan, prasa, pes, človek; viď (Zhangi & Matthews, 2010) pre prehľad sa všeobecne uznáva, že:
- Absorpcia peptidov je lepšia v porovnaní s intaktným proteínom.
- Absorpcia peptidov je lepšia ako voľných aminokyselín.
- Absorpcia malých peptidov je lepšia ako absorpcia veľkých peptidov.
Fyziologicky je väčšina aminokyselín absorbovaná ako malé peptidy pozostávajúce z 2 alebo 3 spojených aminokyselín (di- a tri-peptidy). Preto by sa dalo očakávať, že požitie proteínového hydrolyzátu obsahujúceho vysoké podiely di- a tri-peptidov uľahčí trávenie a absorpciu proteínu, čo vedie k zvýšenej stráviteľnosti a biologickej dostupnosti aminokyselín. Priemerná molekulová hmotnosť aminokyseliny je 110 Daltonov (Da), takže di- a tripeptidy by mali molekulovú hmotnosť približne 220-330 Da (0.2-0.3 kDa). Naše výsledky pri dosahovaní proteínových hydrolyzátov s viac ako 75 % peptidov menších ako 0.5 kDa (tj až ~ 5 aminokyselín) znamenajú, že proteín v našich granulách bude vysoko stráviteľný a ľahko absorbovaný domácimi zvieratami, ktoré ich jedia. Plánuje sa to preukázať prostredníctvom štúdie kŕmenia v spolupráci s Fakultou veterinárneho lekárstva Univerzity v Gente.
Okrem toho, dosiahnutie 100 % peptidov s veľkosťou 3 kDa alebo menej znižuje riziko spustenia alergickej reakcie na zdroje bielkovín, a preto sa môže považovať za hypoalergénne.
Obrázok 2.
Distribúcia veľkosti (kDa) peptidov vo vodnej fáze hydrolyzátov každej suroviny inkubovanej s rovnakým enzýmom za „neoptimalizovaných“ a „optimalizovaných“ podmienok z hľadiska koncentrácie enzýmu a trvania hydrolýzy. Všimnite si najmä, ako percento peptidov medzi 1.0-3.0 kDa klesá a peptidy <0.5 kDa sa zvyšujú, pričom sa pohybujú od „neoptimalizovaných“ k „optimalizovaným“ podmienkam.
Obsah kolagénových peptidov
Pre každú testovanú surovinu mali enzýmy A a C vo všeobecnosti „lepšie“ výsledky (v zmysle získania väčšieho percenta hydroxyprolínu vo vodnej fáze hydrolyzátov) ako enzým B pri porovnaní daného trvania hydrolýzy a koncentrácie enzýmu (napr. výsledky pre lososa na obrázku 3).
Keďže „intaktný“ kolagénový proteín nie je rozpustný vo vode, prítomnosť hydroxyprolínu (náš marker „kolagénu“) vo vodnej fáze naznačuje, že kolagénový proteín bol strávený na kolagénové peptidy (ktoré sú rozpustné vo vode). Naše výsledky ilustrujú, že sme schopní použiť enzymatickú proteolýzu na vytvorenie surovín, ktoré sú schopné priniesť potenciálne funkčné výhody, ako je podpora zdravia kĺbov, zdravia kože a čriev prostredníctvom kolagénových peptidov, ktoré sú v nich prítomné.
OBRÁZOK 3. Percento hydroxyprolínu (aminokyselina nachádzajúca sa takmer výlučne v kolagéne) získaného vo vodnej fáze hydrolyzovaného lososa pomocou troch rôznych enzýmov (A, B alebo C) inkubovaných so surovinou (lososom) v dvoch rôznych koncentráciách (C1 alebo C2) pre dve rôzne časové obdobia (T1 alebo T2).
záver
Tieto pozitívne výsledky predstavujú príležitosti na získanie extra hodnoty z prirodzenej prítomnosti kolagénu v určitých surovinách vytvorením kolagénových peptidov s potenciálom poskytnúť funkčné výhody, ako je udržanie zdravých kĺbov u aktívnych domácich zvierat a zlepšenie mobility a flexibility kĺbov u starších domácich zvierat. príklad.
S vysokým percentom (>75 %) malých peptidov (<0.5 kDa) vyrobených za „optimalizovaných“ podmienok na základe tohto výskumu, prvá časť nášho HDP cieľ je dosiahnutý. Ďalším dôležitým krokom je demonštrovať, že granule vyrobené z tohto HDP sú skutočne stráviteľnejšie a biologicky dostupnejšie ako naše existujúce čerstvo pripravené produkty – sme zaneprázdnení vykonaním tejto štúdie s Univerzita v Gente Veterinárna škola. Sledujte tento priestor!
Referencie
- Cave, N., 2006. Hydrolyzované proteínové diéty pre psov a mačky. Prax veterinárnych kliník pre malé zvieratá, zväzok 36, s. 1251-1268.
- Dai, Z., Wu, Z., Jia, S. & Wu, G., 2014. Analýza zloženia aminokyselín v proteínoch živočíšnych tkanív a potravín ako predkolónových derivátov o-ftaldialdehydu pomocou HPLC s fluorescenčnou detekciou.. J Chromatografia B, zväzok 964, s. 116-127.
- Daniel, H., 2004. Molekulárna a integratívna fyziológia transportu intestinálnych peptidov. Výročný prehľad fyziológie, zväzok 66, s. 361-384.
- Fei, Y. a kol., 1994. Expresné klonovanie cicavčieho oligopeptidového transportéra spojeného s protónom. Náture, zväzok 7, str. 563-566.
- Hanaoka, K. et al., 2019. Charakterizácia molekulovej hmotnosti proteínov a peptidov pri výrobe palatantov krmiva pre domáce zvieratá. [Online] Dostupné na: https://www.diana-petfood.com/emea-en/publications/
- Hou, Y. et al., 2017. Proteínové hydrolyzáty vo výžive zvierat: Priemyselná výroba, bioaktívne peptidy a funkčný význam. Journal of Animal Science and Biotechnology, s. 24-36.
- Knights, R., 1985. Spracovanie a hodnotenie proteínových hydrolyzátov. In: Výživa pre špeciálne potreby. New York: Marcel Dekker, s. 105-115.
- MINTEL, 2017. Väčšia transparentnosť z hľadiska bielkovín v krmive pre domáce zvieratá, sl: MINTEL REPORTS.
- Pasupuleki, VK, Braun, S, 2010. Najmodernejšia výroba proteínových hydrolyzátov. In: Proteínové hydrolyzáty v biotechnológii. New York: Springer, s. 11-32.
- Zhangi, B. & Matthews, J., 2010. Fyziologický význam a mechanizmy absorpcie proteínového hydrolyzátu. In: Proteínové hydrolyzáty v biotechnológii. New York: Springer, s. 135-177.