Utvikling av proteinhydrolysetilnærming for å øke de ernæringsmessige fordelene av ferskt tilberedt kjøtt og fisk.
En vitenskapelig støtteartikkel av Dr Adrian Hewson-Hughes | Rådgiver for ernæring, mattrygghet og innovasjon, GA Pet Food Partners.
Introduksjon.
Innholdet av animalsk protein er veletablert som essensen av førsteklasses kvalitetsfôr for hunder og katter, og mange kjæledyreiere erkjenner at ordtaket "kvalitet fremfor kvantitet" gjelder her. I følge markedsundersøkelsesselskapet Mintel sier 59 % av katteeierne og 57 % av hundeeierne at kvaliteten på kjøtt er viktigere enn det totale kjøttinnholdet i kjæledyrfôr (MINTEL, 2017).
GA Pet Food Partners har lenge erkjent dette. Siden introduksjonen av Freshtrusion®, GA har ledet an i utvikling og produksjon av dietter som inneholder økende mengder nylaget kjøtt og fiskeproteinkilder. Fordelene ved å bruke ferske kjøtt- og fiskekilder fremfor tørkede, smeltede kjøtt- og fiskemåltider, inkludert bedre smak og økt fordøyelighet, er godt verdsatt av både kjæledyr og deres eiere.
Vi streber etter å tilby våre partnere enda bedre produkter.
Kjæledyrmatmarkedet er veldig dynamisk, og selv om det er et klokt grep å fremheve den nøyaktige høye andelen kjøtt/fisk/fjærfe i produkter, er dette i ferd med å bli en grunnleggende forventning i stedet for den ønskede kvaliteten for disse produktene fra dyreeiere. Her på GA streber vi hele tiden etter måter å tilby partnere enda bedre produkter, og det er derfor vi satte oss for å gjøre det tilsynelatende umulige – finne på en måte å tilberede våre ferske kjøtt- og fiskeingredienser for å gjøre dem enda bedre for kjæledyr. .
Tanken er å øke næringsverdien til proteinet i våre ferske kjøtt- og fiskeingredienser ved å omdanne proteinet til små peptider, som lettere absorberes av kjæledyrene som spiser det (vi kaller det 'HDP' – Highly Digestible Protein). For å hjelpe oss i dette oppdraget identifiserte vi eksperter ved Nofima, et ledende forskningsinstitutt for anvendt matforskning basert i Norge, for å optimalisere forholdene for enzymatisk fordøyelse av utvalgte kjøtt- og fiskeråvarer og analysere dem for å vise at vi kunne oppnå det vi ønsket. .
Proteinfordøyelse – også kjent som proteolyse eller hydrolyse
Proteiner er store molekyler som består av individuelle "byggesteiner" kalt aminosyrer. Etter å ha spist mat som inneholder protein, begynner prosessen med proteolyse ved at enzymer som frigjøres i forskjellige deler av mage-tarmkanalen bryter det ned til aminosyrer og små peptider. Dette gjør at disse byggesteinene kan tas opp i kroppen, hvor de kan rekombineres for å bygge nye proteiner (som muskler, hud, hår, antistoffer, enzymer, hormoner osv.).
Det er også mulig for proteinkilder å gjennomgå en kontrollert enzymatisk proteolyseprosess som en del av deres forberedelse for inkludering i produserte matvarer og ernæringsprodukter. For eksempel har proteinhydrolysater blitt brukt i flere tiår i menneskelig ernæring, spesielt i produksjonen av hypoallergene spedbarnsmelkerstatninger for babyer/barn som er allergiske mot kumelkprotein.
Enzymatisk eller kjemisk hydrolyse
Proteinhydrolyse – brudd av peptidbindinger som binder aminosyrer sammen gjennom tilsetning av vann – kan oppnås ved forskjellige metoder: kjemisk ved bruk av syrer eller baser (alkaliske) eller enzymatisk (tilnærmingen vi fokuserer på). Mens metodene for sur og alkalisk hydrolyse av proteiner gir fordelen med lave kostnader, er det negative konsekvenser når det gjelder den ernæringsmessige kvaliteten til de produserte hydrolysatene. Syrehydrolyse resulterer i fullstendig ødeleggelse av den essensielle aminosyren tryptofan, samt delvis tap av metionin, cystin og cystein (Pasupuleki & Braun, 2010). Tilsvarende resulterer alkalisk hydrolyse i fullstendig ødeleggelse av de fleste aminosyrer, selv om tryptofan kan overleve intakt (Dai, et al., 2014), (Hou, et al., 2017).
Sammenlignet med sur og alkalisk hydrolyse er hovedfordelene med enzymatisk hydrolyse av proteiner:
- Hydrolyseforholdene som temperatur og pH er milde og resulterer ikke i noe kjent tap av aminosyrer.
- Bruken av proteaseenzym(er) er mer spesifikk og presis for å kontrollere omfanget av hydrolyse og størrelsen på peptider.
- De små mengdene enzym som brukes kan enkelt deaktiveres (f.eks. oppvarming til 80 – 85ºC i minst 3 minutter) for å stoppe hydrolysereaksjonen. (Hou, et al., 2017).
Ernæringsmessige fordeler av enzymatisk hydrolysert protein: proteinfordøyelighet og absorpsjon.
I tillegg til metoden for proteinhydrolyse som brukes, som skissert tidligere, avhenger næringsverdien til proteinhydrolysater av sammensetningen av frie aminosyrer, små peptider (typisk di- og tri-peptider) og store peptider tilstede. Historisk sett ble det antatt at bare frie aminosyrer ble absorbert fra mage-tarmkanalen av spesifikke aminosyretransportører. Dette skjer, men det er nå anerkjent at flertallet av aminosyrer absorberes som di- og tri-peptider av den bredspesifisitet peptidtransportøren PepT1 (Fei, et al., 1994). PepT1 kan potensielt transportere alle 400 di-peptider og 8,000 tri-peptider som er et resultat av å kombinere de 20 forskjellige diettaminosyrene (Daniel, 2004). Derfor vil det forventes at inntak av et proteinhydrolysat som inneholder høye andeler di- og tri-peptider vil lette proteinfordøyelsen og absorpsjonen, noe som resulterer i økt fordøyelighet og aminosyrebiotilgjengelighet.
Det er klart at det å etablere de beste enzym- og hydrolyseforholdene er avgjørende for å kunne lage proteinhydrolysater med de ønskede endelige peptidstørrelsesprofilene. Peptidstørrelsesfordeling kan bestemmes ved hjelp av en teknikk kalt størrelseseksklusjonskromatografi. Størrelseseksklusjonskromatografi (SEC) er en analytisk kjemiteknikk der blandinger av molekyler (som proteiner eller peptider) oppløst i en løsning separeres etter størrelse (som skissert i figur 1).
Figur 1. Enkel oversikt over separasjon av molekyler av forskjellige størrelser i en løsning ved størrelseseksklusjonskromatografi (SEC). Løsningen påføres en kolonne som er pakket med en harpiks av porøse sfæriske kuler (grå kuler). Store molekyler (røde sirkler) vil ikke kunne trenge inn i porene (hullene) i kulene og passerer derfor relativt raskt nedover kolonnen og vil bli oppdaget først. Mindre molekyler i prøven kan komme inn i porene i varierende grad avhengig av størrelsen. 'Mellomstore' molekyler (grønne sirkler) vil kunne gå inn i noen perler, men ikke andre, og vil derfor ta lengre tid å passere gjennom kolonnen, mens de minste molekylene (blå sirkler) vil kunne gå inn i alle porene og vil ta den lengste som passerer gjennom kolonnen.
Metoder
raw Materials – Ferske prøver av kyllingskrott, andeskrott og lakserammer ble størrelsesminsket, homogenisert til en tykk pasta og frosset. Fersk lammelever ble frosset hel. Materialene ble sendt til Nofima, Ås, Norge, for proteolyse og analyse.
Proteolyse – For hvert råmateriale (kylling, and, laks og lam) ble en prøve på 500 g blandet med 990 ml destillert vann i en reaksjonskar av glass og omrørt ved 300 rpm. For hvert råmateriale ble tre forskjellige proteaseenzymer testet ved to forskjellige konsentrasjoner og to tidspunkter, noe som resulterte i 48 hydrolysatprøver for analyse.
Størrelsesekskluderingskromatografi – Molekylvektfordelingen til den vannløselige proteinfraksjonen av hydrolysatene ble bestemt ved størrelseseksklusjonskromatografi ved bruk av et Shimadzu LC-20AT høyytelses væskekromatografi (HPLC) system med en fotodiode array detektor (SPD M20A) satt til 214nm.
Kollagenpeptidinnhold – Hydroksyprolin er en modifisert aminosyre, hvis tilstedeværelse hovedsakelig er begrenset til kollagen. Hydroksyprolininnhold i proteinhydrolysater kan brukes som et indirekte mål på mengden kollagen/kollagenpeptider som er tilstede. En fullstendig aminosyreanalyse (inkludert hydroksyprolin) av hvert råmateriale ble utført av Nofima Biolab; i tillegg ble hydroksyprolininnholdet bestemt ved et akkreditert laboratorium (ALS, Norge) i den vannløselige fraksjonen av hydrolysatene.
Resultater
Peptidstørrelsesfordeling av hydrolysater – Generelt, for hvert testet enzym, resulterte inkubering av hvert råmateriale med den høyere konsentrasjonen av enzym og over lengre varighet i et "gunstig" skifte i peptidstørrelsesprofilen til hydrolysatene (dvs. en økning i andelen mindre peptider) ). Dette er fremhevet i figur 2, som viser resultater for hvert råmateriale ved å bruke det 'beste' enzymet ved 'ikke-optimal' konsentrasjon og varighet sammenlignet med 'optimal' konsentrasjon og varighet. Med optimaliserte forhold fant vi at 100 % av peptidene var ≤3 kDa, og mer enn 75 % var <0.5 kDa (figur 2).
Basert på det samlede beviset fra flere studier på en rekke arter (f.eks. rotter, gris, hund, mennesker; se (Zhangi & Matthews, 2010) for en oversikt er det generelt godt akseptert at:
- Absorpsjon av peptider er bedre sammenlignet med intakt protein.
- Absorpsjon av peptider er bedre enn frie aminosyrer.
- Absorpsjon av små peptider er bedre enn av store peptider.
Fysiologisk absorberes flertallet av aminosyrene som små peptider som består av 2 eller 3 aminosyrer koblet sammen (henholdsvis di- og tri-peptider). Derfor vil det forventes at inntak av et proteinhydrolysat som inneholder høye andeler di- og tri-peptider vil lette proteinfordøyelsen og absorpsjonen, noe som resulterer i økt fordøyelighet og aminosyrebiotilgjengelighet. Den gjennomsnittlige molekylvekten til en aminosyre er 110 Dalton (Da), så di- og tri-peptider vil ha en molekylvekt på omtrent 220-330 Da (0.2-0.3 kDa). Våre resultater i å oppnå proteinhydrolysater med mer enn 75 % av peptider mindre enn 0.5 kDa (dvs. opptil ~ 5 aminosyrer) betyr at proteinet i kibblene våre vil være svært fordøyelige og lett absorberes av kjæledyrene som spiser det. Det er planlagt å demonstrere dette gjennom en fôringsstudie i samarbeid med Fakultet for veterinærmedisin, Universitetet i Gent.
I tillegg reduserer å oppnå 100 % av peptider på 3 kDa eller mindre risikoen for å utløse en allergisk reaksjon på proteinkildene og kan derfor betraktes som hypoallergen.
Figur 2.
Størrelsesfordeling (kDa) av peptider i vannfasen av hydrolysater av hvert råmateriale inkubert med det samme enzymet under 'ikke-optimaliserte' og 'optimaliserte' forhold når det gjelder enzymkonsentrasjon og varighet av hydrolyse. Legg spesielt merke til hvordan prosentandelen av peptider mellom 1.0-3.0 kDa avtar og peptider <0.5 kDa øker, og går fra 'ikke-optimaliserte' til 'optimerte' forhold.
Kollagenpeptidinnhold
For hvert råmateriale som ble testet, presterte enzym A og C generelt "bedre" (med hensyn til å gjenvinne en større prosentandel av hydroksyprolin i vannfasen av hydrolysatene) enn enzym B når man sammenligner en gitt varighet av hydrolyse og enzymkonsentrasjon (se f.eks. resultater for laks i figur 3).
Siden 'intakt' kollagenprotein ikke er løselig i vann, indikerer tilstedeværelsen av hydroksyprolin (vår markør for 'kollagen') i vannfasen at kollagenproteinet er blitt fordøyd til kollagenpeptider (som er vannløselige). Resultatene våre illustrerer at vi er i stand til å bruke enzymatisk proteolyse for å lage råvarer som er i stand til å gi potensielle funksjonelle fordeler som å støtte leddhelse, hudhelse og tarmhelse gjennom kollagenpeptidene som finnes i dem.
FIGUR 3. Andel hydroksyprolin (en aminosyre som nesten utelukkende finnes i kollagen) gjenvunnet i vannfasen til hydrolysert laks med tre forskjellige enzymer (A, B eller C) inkubert med råstoffet (laks) i to forskjellige konsentrasjoner (C1 eller C2) for to forskjellige tidsperioder (T1 eller T2).
konklusjonen
Disse positive resultatene gir muligheter til å få ekstra verdi fra den naturlige tilstedeværelsen av kollagen i visse råvarer ved å lage kollagenpeptider med potensiale til å levere funksjonelle fordeler som å opprettholde sunne ledd hos aktive kjæledyr og forbedre mobiliteten og fleksibiliteten til leddene hos eldre kjæledyr, for eksempel.
Med den høye prosentandelen (>75 %) av små peptider (<0.5 kDa) produsert under 'optimaliserte' forhold basert på denne forskningen, er den første delen av vår HDP målet er oppnådd. Det neste viktige trinnet er å demonstrere at kibble laget med denne HDP-en faktisk er mer fordøyelig og biotilgjengelig enn våre eksisterende ferske produkter – vi er opptatt med å utføre dette i en fôringsstudie med Universitetet i Gent Veterinærskole. Se denne plassen!
Referanser
- Cave, N., 2006. Hydrolyserte proteindietter for hunder og katter. Veterinærklinikker Small Animal Practice, bind 36, s. 1251-1268.
- Dai, Z., Wu, Z., Jia, S. & Wu, G., 2014. Analyse av aminosyresammensetning i proteiner i animalsk vev og mat som pre-kolonne o-fthaldialdehydderivater ved HPLC med fluorescensdeteksjon.. J Chromatography B, bind 964, s. 116-127.
- Daniel, H., 2004. Molecular and integrative physiology of intestinal peptide transport.. Annual Review of Physiology, bind 66, s. 361-384.
- Fei, Y. et al., 1994. Ekspresjonskloning av en pattedyrprotonkoblet oligopeptidtransportør. Nature, bind 7, s. 563-566.
- Hanaoka, K. et al., 2019. Karakterisering av proteiner og peptider molekylvekt under produksjon av kjæledyrsmat. [Online] Tilgjengelig på: https://www.diana-petfood.com/emea-en/publications/
- Hou, Y. et al., 2017. Proteinhydroysater i dyreernæring: Industriell produksjon, bioaktive peptider og funksjonell betydning. Journal of Animal Science and Biotechnology, s. 24-36.
- Knights, R., 1985. Bearbeiding og evaluering av proteinhydrolysater. I: Ernæring for spesielle behov. New York: Marcel Dekker, s. 105-115.
- MINTEL, 2017. Større åpenhet når det gjelder protein i kjæledyrmat, sl: MINTEL RAPPORTER.
- Pasupuleki, VK, Braun, S, 2010. Toppmoderne produksjon av proteinhydrolysater. I: Protein Hydrolysates in Biotechnology. New York: Springer, s. 11-32.
- Zhangi, B. & Matthews, J., 2010. Fysiologisk betydning og mekanismer for proteinhydrolysatabsorpsjon. I: Protein Hydrolysates in Biotechnology. New York: Springer, s. 135-177.