Baltymų hidrolizės metodo kūrimas siekiant padidinti šviežiai paruoštos mėsos ir žuvies maistinę naudą.

Dr Adrian Hewson-Hughes mokslinis pagalbinis dokumentas | Mitybos, maisto saugos ir inovacijų patarėjas, GA Pet Food Partners.

Įvadas.

Gyvūninių baltymų kiekis yra gerai žinomas kaip aukščiausios kokybės šunų ir kačių pašarų esmė, todėl daugelis naminių gyvūnėlių savininkų pripažįsta, kad čia galioja posakis „kokybė, o ne kiekybė“. Rinkos tyrimų bendrovės „Mintel“ duomenimis, 59% kačių savininkų ir 57% šunų savininkų teigia, kad mėsos kokybė yra svarbesnė už bendrą mėsos kiekį naminių gyvūnėlių maiste. (MINTEL, 2017).

GA Pet Food Partners jau seniai tai pripažino. Nuo pat įvedimo Freshtrusion®, GA pirmavo kuriant ir gaminant dietas, kuriose yra vis daugiau šviežiai paruoštų mėsos ir žuvies baltymų šaltinių. Naminiai gyvūnai ir jų šeimininkai puikiai vertina šviežios mėsos ir žuvies šaltinių naudojimo pranašumus, palyginti su džiovintais, lydytais mėsos ir žuvies miltais, įskaitant geresnį skonį ir didesnį virškinamumą.

Siekiame pasiūlyti savo partneriams dar geresnius produktus.

Gyvūnų ėdalo rinka yra labai dinamiška ir, nors tiksliai pabrėžti didelę mėsos / žuvies / paukštienos dalį produktuose yra protingas žingsnis, tai tampa pagrindiniu lūkesčiu, o ne norima šių produktų kokybe iš naminių gyvūnėlių savininkų. Čia, GA, nuolat ieškome būdų, kaip pasiūlyti partneriams dar geresnius produktus, todėl nusprendėme padaryti tai, kas atrodo neįmanoma – sugalvoti būdą, kaip paruošti mūsų šviežios mėsos ir žuvies ingredientus, kad jie būtų dar geresni naminiams gyvūnėliams. .

Idėja yra padidinti mūsų šviežios mėsos ir žuvies ingredientų baltymų maistinę vertę paverčiant baltymus mažais peptidais, kuriuos lengviau pasisavina juos valgantys augintiniai (vadiname jį HDP – labai virškinamu baltymu). Siekdami padėti mums atlikti šią užduotį, mes suradome Nofimos – pirmaujančio taikomųjų maisto tyrimų instituto Norvegijoje – ekspertus, kurie optimizuotų pasirinktų mėsos ir žuvies žaliavų fermentinio virškinimo sąlygas ir jas analizuotų, kad parodytume, jog galime pasiekti tai, ko norėjome. .

Baltymų virškinimas – dar žinomas kaip proteolizė arba hidrolizė

Baltymai yra didelės molekulės, sudarytos iš atskirų „statybinių blokų“, vadinamų aminorūgštimis. Suvalgius maistą, kuriame yra baltymų, prasideda proteolizės procesas, nes įvairiose virškinimo trakto dalyse išsiskiriantys fermentai suskaido jį į aminorūgštis ir mažus peptidus. Tai leidžia šiems statybiniams blokams įsisavinti organizmą, kur juos galima rekombinuoti, kad susidarytų nauji baltymai (pvz., raumenys, oda, plaukai, antikūnai, fermentai, hormonai ir kt.).

Taip pat baltymų šaltiniams gali būti taikomas kontroliuojamas fermentinės proteolizės procesas, kai jie ruošiami įtraukti į gaminamus maisto produktus ir maistinius produktus. Pavyzdžiui, baltymų hidrolizatai žmonių mityboje buvo naudojami dešimtmečius, ypač gaminant hipoalerginius pieno mišinius kūdikiams/vaikams, alergiškiems karvės pieno baltymams.

Fermentinė arba cheminė hidrolizė

Baltymų hidrolizė – peptidinių ryšių, jungiančių aminorūgštis kartu pridedant vandens, nutraukimas gali būti pasiektas įvairiais būdais: chemiškai naudojant rūgštis arba bazes (šarminis) arba fermentiniu būdu (į kurį mes orientuojamės). Nors baltymų rūgštinės ir šarminės hidrolizės metodai pasižymi mažomis sąnaudomis, tai turi neigiamų pasekmių gaminamų hidrolizatų maistinei kokybei. Rūgštinė hidrolizė sukelia visišką nepakeičiamos aminorūgšties triptofano sunaikinimą, taip pat dalinį metionino, cistino ir cisteino praradimą. (Pasupuleki ir Braun, 2010). Panašiai šarminė hidrolizė visiškai sunaikina daugumą aminorūgščių, nors triptofanas gali išgyventi nepakitęs (Dai, et al., 2014), (Labas, et al., 2017).

Palyginti su rūgštine ir šarmine hidrolize, pagrindiniai fermentinės baltymų hidrolizės pranašumai yra šie:

  1. Hidrolizės sąlygos, tokios kaip temperatūra ir pH, yra švelnios ir dėl to netenkama jokių aminorūgščių.
  2. Proteazės fermento (-ų) naudojimas yra specifiškesnis ir tikslesnis kontroliuojant hidrolizės mastą ir peptidų dydį.
  3. Nedidelį naudojamo fermento kiekį galima lengvai deaktyvuoti (pvz., kaitinant iki 80–85ºC bent 3 minutes), kad sustabdytų hidrolizės reakciją. (Labas, et al., 2017).

Fermentiškai hidrolizuotų baltymų maistinė nauda: baltymų virškinamumas ir įsisavinimas.

Be naudojamo baltymų hidrolizės metodo, kaip aprašyta anksčiau, baltymų hidrolizatų maistinė vertė priklauso nuo laisvųjų aminorūgščių, mažų peptidų (paprastai di- ir tripeptidų) ir didelių peptidų sudėties. Istoriškai buvo manoma, kad specifiniai aminorūgščių pernešėjai iš virškinimo trakto absorbuoja tik laisvas aminorūgštis. Taip atsitinka, tačiau dabar pripažįstama, kad daugumą aminorūgščių kaip di- ir tripeptidus absorbuoja plataus specifiškumo peptidų transporteris PepT1. (Fei, et al., 1994). PepT1 gali potencialiai transportuoti visus 400 dipeptidų ir 8,000 tripeptidų, atsirandančių sujungus 20 skirtingų dietinių aminorūgščių. (Danielis, 2004 m.). Todėl tikimasi, kad baltymų hidrolizato, kuriame yra daug di- ir tripeptidų, suvartojimas palengvintų baltymų virškinimą ir absorbciją, todėl padidėtų virškinamumas ir aminorūgščių biologinis prieinamumas.

Akivaizdu, kad labai svarbu sukurti geriausias fermentų ir hidrolizės sąlygas, kad būtų galima sukurti baltymų hidrolizatus su norimais galutiniais peptidų dydžio profiliais. Peptidų dydžio pasiskirstymas gali būti nustatytas naudojant metodą, vadinamą dydžio išskyrimo chromatografija. Dydžio išskyrimo chromatografija (SEC) yra analitinės chemijos metodas, kai tirpale ištirpusių molekulių (pvz., baltymų ar peptidų) mišiniai yra atskiriami pagal jų dydį (kaip parodyta 1 paveiksle).

1 pav. Paprasta skirtingų dydžių molekulių atskyrimo tirpale apžvalga naudojant dydžio išskyrimo chromatografiją (SEC). Tirpalas tepamas ant kolonėlės, kuri yra užpildyta akytų sferinių granulių (pilkų rutulių) derva. Didelės molekulės (raudoni apskritimai) negalės patekti į karoliukų poras (angas), todėl gana greitai prasiskverbia kolona ir bus aptiktos pirmiausia. Mažesnės molekulės mėginyje gali patekti į poras skirtingu laipsniu, priklausomai nuo jų dydžio. „Vidutinio dydžio“ molekulės (žali apskritimai) galės patekti į vienus karoliukus, bet ne į kitus, todėl praeis pro kolonėlę ilgiau, o mažiausios molekulės (mėlyni apskritimai) galės patekti į visas poras ir užtruks. ilgiausiai praeina pro koloną.

Metodai

Žaliavos – Švieži vištienos skerdenos, ančių skerdenos ir lašišos rėmų mėginiai buvo sumažinti, homogenizuoti į tirštą pastą ir užšaldyti. Šviežios ėriukų kepenėlės buvo užšaldytos sveikos. Medžiaga buvo išsiųsta į „Nofima“, Ås, Norvegija, proteolizei ir analizei.

Proteolizė – Kiekvienos žaliavos (vištiena, antiena, lašiša ir ėriena) 500 g mėginys buvo sumaišytas su 990 ml distiliuoto vandens stikliniame reakcijos inde ir maišomas 300 aps./min. Kiekvienai žaliavai buvo išbandyti trys skirtingi proteazės fermentai, esant dviem skirtingoms koncentracijoms ir dviem laiko taškams, todėl analizei gauti 48 hidrolizato mėginiai.

Dydžio išskyrimo chromatografija – Hidrolizatų vandenyje tirpių baltymų frakcijos molekulinės masės pasiskirstymas buvo nustatytas dydžių išskyrimo chromatografija, naudojant Shimadzu LC-20AT aukštos kokybės skysčių chromatografijos (HPLC) sistemą su fotodiodų matricos detektoriumi (SPD M20A), nustatyta 214 nm.

Kolageno peptidų kiekis – Hidroksiprolinas yra modifikuota aminorūgštis, kurios buvimas daugiausia apsiriboja kolagenu. Hidroksiprolino kiekis baltymų hidrolizatuose gali būti naudojamas kaip netiesioginis kolageno / kolageno peptidų kiekio matas. Išsamią kiekvienos žaliavos aminorūgščių analizę (įskaitant hidroksiproliną) atliko Nofima Biolab; be to, akredituotoje laboratorijoje (ALS, Norvegija) nustatytas hidroksiprolino kiekis vandenyje tirpioje hidrolizatų frakcijoje.

rezultatai

Hidrolizatų pasiskirstymas pagal peptidų dydį – Apskritai, kiekvieno ištirto fermento atveju kiekvienos žaliavos su didesne fermento koncentracija ir ilgesnis inkubavimas lėmė „naudingą“ hidrolizatų peptidų dydžio poslinkį (ty padidėjo mažesnių peptidų dalis). ). Tai paryškinta 2 paveiksle, kuriame rodomi kiekvienos žaliavos, naudojant „geriausią“ fermentą, esant „neoptimaliai“ koncentracijai ir trukmei, rezultatai, palyginti su „optimalia“ koncentracija ir trukme. Optimizuotomis sąlygomis nustatėme, kad 100 % peptidų buvo ≤3 kDa, o daugiau nei 75 % – < 0.5 kDa (2 pav.).

Remiantis kolektyviniais kelių rūšių tyrimais (pvz., žiurkėmis, kiaulėmis, šunimis, žmonėmis; žr (Zhangi & Matthews, 2010) Apžvalgai paprastai pripažįstama, kad:

  • Peptidų absorbcija yra geresnė nei nepažeisto baltymo.
  • Peptidai absorbuojami geriau nei laisvosios aminorūgštys.
  • Maži peptidai absorbuojami geriau nei dideli peptidai.

Fiziologiškai dauguma aminorūgščių yra absorbuojamos kaip maži peptidai, susidedantys iš 2 arba 3 tarpusavyje sujungtų aminorūgščių (atitinkamai di- ir tripeptidai). Todėl tikimasi, kad baltymų hidrolizato, kuriame yra daug di- ir tripeptidų, suvartojimas palengvintų baltymų virškinimą ir absorbciją, todėl padidėtų virškinamumas ir aminorūgščių biologinis prieinamumas. Vidutinė aminorūgšties molekulinė masė yra 110 daltonų (Da), taigi di- ir tripeptidų molekulinė masė būtų maždaug 220-330 Da (0.2-0.3 kDa). Mūsų rezultatai, kai gaunami baltymų hidrolizatai, kuriuose yra daugiau nei 75 % peptidų, mažesnių nei 0.5 kDa (ty iki ~ 5 aminorūgščių), reiškia, kad baltymai mūsų trupiniuose būtų gerai virškinami ir lengvai įsisavinami juos valgančių augintinių. Tai planuojama pademonstruoti per šėrimo tyrimą bendradarbiaujant su Gento universiteto Veterinarijos fakultetu.

Be to, pasiekus 100 % 3 kDa ar mažesnių peptidų, sumažėja alerginės reakcijos į baltymų šaltinius atsiradimo rizika, todėl jie gali būti laikomi hipoalerginiais.

2 pav.

Peptidų dydžio pasiskirstymas (kDa) kiekvienos žaliavos hidrolizatų, inkubuotų su tuo pačiu fermentu, vandeninėje fazėje „neoptimizuotomis“ ir „optimizuotomis“ sąlygomis pagal fermento koncentraciją ir hidrolizės trukmę. Ypač atkreipkite dėmesį, kaip mažėja 1.0–3.0 kDa peptidų procentas, o <0.5 kDa – didėja, pereinant nuo „neoptimizuotų“ prie „optimizuotų“ sąlygų.

Antis (neoptimizuota)

Antis (optimizuota)

Lašiša (neoptimizuota)

Lašiša (optimizuota)

Vištiena (neoptimizuota)

Vištiena (optimizuota)

Ėriena (neoptimizuota)

Ėriena (optimizuota)

Kolageno peptidų kiekis

Lyginant tam tikrą hidrolizės trukmę ir fermento koncentraciją, kiekvienos ištirtos žaliavos atveju fermentai A ir C veikė „geriau“ (kalbant apie tai, kad hidrolizatų vandeninėje fazėje buvo atgaunama didesnė hidroksiprolino dalis) nei fermentas B. lašišos rezultatai 3 paveiksle).

Kadangi „nepažeistas“ kolageno baltymas netirpsta vandenyje, hidroksiprolino (mūsų „kolageno“ žymeklio) buvimas vandens fazėje rodo, kad kolageno baltymas buvo suskaidytas į kolageno peptidus (tirpius vandenyje). Mūsų rezultatai rodo, kad galime naudoti fermentinę proteolizę, kad sukurtume žaliavas, kurios gali duoti potencialios funkcinės naudos, pvz., palaikyti sąnarių, odos ir žarnyno sveikatą per juose esančius kolageno peptidus.

3 pav. Hidroksiprolino (aminorūgšties, randamos beveik vien kolagene) procentinė dalis, išgauta hidrolizuotos lašišos vandens fazėje su trimis skirtingais fermentais (A, B arba C), inkubuota su žaliava (lašiša), esant dviem skirtingoms koncentracijoms (C1 arba C2). du skirtingi laikotarpiai (T1 arba T2).

Išvada

Šie teigiami rezultatai suteikia galimybę gauti papildomos naudos iš natūralaus kolageno buvimo tam tikrose žaliavose, sukuriant kolageno peptidus, galinčius suteikti funkcinės naudos, pavyzdžiui, palaikyti sveikus aktyvių augintinių sąnarius ir pagerinti vyresnio amžiaus augintinių sąnarių mobilumą ir lankstumą. pavyzdys.

Atsižvelgiant į didelį procentą (>75 %) mažų peptidų (<0.5 kDa), pagamintų „optimizuotomis“ sąlygomis remiantis šiuo tyrimu, pirmoji mūsų tyrimo dalis. HDP tikslas pasiektas. Kitas svarbus žingsnis – parodyti, kad su šiuo HDP pagaminti trupiniai iš tiesų yra geriau virškinami ir biologiškai prieinamesni nei mūsų esami šviežiai paruošti produktai – mes esame užsiėmę tai atlikdami šėrimo tyrimą su Gento universitetas Veterinarijos mokykla. Stebėkite šią erdvę!

Atsisiųskite mūsų HDP ataskaitą

Nuorodos

  1. Cave, N., 2006. Hidrolizuotų baltymų dietos šunims ir katėms. Veterinarijos klinikų smulkių gyvūnų praktika, 36 tomas, 1251-1268 p.
  2. Dai, Z., Wu, Z., Jia, S. & Wu, G., 2014. Aminorūgščių sudėties gyvūnų audinių ir maisto baltymų kaip prieškoloninio o-ftaldialdehido darinių analizė HPLC su fluorescencijos nustatymu. Chromatography B, 964 tomas, p. 116-127.
  3. Daniel, H., 2004. Molecular and integrative physiology of intestinal peptide transport.. Annual Review of Physiology, Volume 66, p. 361-384.
  4. Fei, Y. ir kt., 1994. Žinduolių su protonu sujungto oligopeptido transporterio ekspresinis klonavimas. Nature, 7 tomas, p. 563-566.
  5. Hanaoka, K. ir kt., 2019. Baltymų ir peptidų molekulinės masės apibūdinimas gaminant naminių gyvūnėlių ėdalo skonį. [Internetu] Prieiga prie: https://www.diana-petfood.com/emea-en/publications/
  6. Hou, Y. ir kt., 2017. Baltymų hidroizatai gyvūnų mityboje: pramoninė gamyba, bioaktyvūs peptidai ir funkcinė reikšmė. Žurnalas „Animal Science and Biotechnology“, p. 24–36.
  7. Knights, R., 1985. Baltymų hidrolizatų apdorojimas ir įvertinimas. In: Specialiųjų poreikių mityba. Niujorkas: Marcel Dekker, p. 105–115.
  8. MINTEL, 2017. Didesnis skaidrumas kalbant apie baltymus naminių gyvūnėlių maiste, sl: MINTEL REPORTS.
  9. Pasupuleki, VK, Braun, S, 2010. Šiuolaikinė baltymų hidrolizatų gamyba. In: Protein Hydrolysates in Biotechnology. Niujorkas: Springer, p. 11–32.
  10. Zhangi, B. & Matthews, J., 2010. Baltymų hidrolizato absorbcijos fiziologinė svarba ir mechanizmai. In: Protein Hydrolysates in Biotechnology. New York: Springer, p. 135–177.