Þróun próteinvatnsrofsaðferðar til að auka næringarávinning nýlagaðs kjöts og fisks.
Vísindaleg stuðningsgrein eftir Dr Adrian Hewson-Hughes | Næringar-, matvælaöryggis- og nýsköpunarráðgjafi, GA Pet Food Partners.
Inngangur.
Dýrapróteininnihald er vel þekkt sem kjarninn í hágæðafóðri fyrir hunda og ketti og margir gæludýraeigendur viðurkenna að orðtakið „gæði fram yfir magn“ á við hér. Samkvæmt markaðsrannsóknarfyrirtækinu Mintel segja 59% kattaeigenda og 57% hundaeigenda að gæði kjöts skipti meira máli en heildar kjötinnihald í gæludýrafóðri. (MINTEL, 2017).
GA Pet Food Partners hefur fyrir löngu viðurkennt þetta. Frá kynningu á Freshtrusion®, GA hefur verið leiðandi í þróun og framleiðslu á fæði sem inniheldur vaxandi magn af nýlöguðu kjöti og fiskpróteini. Kostir þess að nota ferskt kjöt og fisk fram yfir þurrkað, brædd kjöt- og fiskmáltíð, þar á meðal betra bragð og aukinn meltanleiki, eru vel metnir af bæði gæludýrum og eigendum þeirra.
Leitast við að bjóða samstarfsaðilum okkar enn betri vörur.
Gæludýrafóðursmarkaðurinn er mjög kraftmikill og þó að það sé skynsamleg ráðstöfun að undirstrika nákvæmlega hátt hlutfall kjöts/fisks/alifugla í vörum, er þetta að verða grunnvænting frekar en æskileg gæði fyrir þessar vörur frá gæludýraeigendum. Hér hjá GA erum við stöðugt að leita leiða til að bjóða samstarfsaðilum enn betri vörur og þess vegna ætluðum við að gera það sem virðist ómögulegt - koma með leið til að elda ferskt kjöt og fiskhráefni til að gera það enn betra fyrir gæludýr .
Hugmyndin er að auka næringargildi próteinsins í fersku kjöti og fiski hráefninu okkar með því að breyta próteininu í lítil peptíð, sem frásogast auðveldara af gæludýrum sem borða það (við köllum það 'HDP' – Highly Digestible Protein). Til að hjálpa okkur í þessari leit, fundum við sérfræðinga hjá Nofima, leiðandi rannsóknarstofnun fyrir hagnýtar matvælarannsóknir með aðsetur í Noregi, til að hámarka skilyrði fyrir ensímmeltingu valinna kjöt- og fiskhráefna og greina þau til að sýna fram á að við gætum náð því sem við vildum. .
Próteinmelting - aka próteingreining eða vatnsrof
Prótein eru stórar sameindir sem samanstanda af einstökum „byggingaeiningum“ sem kallast amínósýrur. Eftir að hafa borðað mat sem inniheldur prótein byrjar próteingreiningarferlið þar sem ensím sem losna á mismunandi stöðum í meltingarveginum brjóta það niður í amínósýrur og lítil peptíð. Þetta gerir þessum byggingareiningum kleift að frásogast líkamann, þar sem hægt er að sameina þær aftur til að byggja upp ný prótein (eins og vöðva, húð, hár, mótefni, ensím, hormón osfrv.).
Það er einnig mögulegt fyrir próteingjafa að gangast undir stýrt ensímpróteingreiningarferli sem hluti af undirbúningi þeirra fyrir innlimun í framleidd matvæli og næringarvörur. Sem dæmi má nefna að próteinvatnsrof hafa verið notuð í áratugi í næringu manna, einkum við framleiðslu á ofnæmisvaldandi ungbarnamjólkurblöndu fyrir börn/börn með ofnæmi fyrir kúamjólkurpróteini.
Ensím- eða efnafræðileg vatnsrof
Vatnsrof próteina – brot á peptíðtengjum sem tengja amínósýrur saman með því að bæta við vatni – er hægt að ná með mismunandi aðferðum: efnafræðilega með því að nota sýrur eða basa (basískt) eða ensímfræðilegt (aðferðin sem við leggjum áherslu á). Þó að aðferðirnar við sýru- og basískt vatnsrof próteina hafi kost á litlum tilkostnaði, hafa neikvæðar afleiðingar í för með sér hvað varðar næringargæði vatnsrofanna sem framleidd eru. Sýra vatnsrof leiðir til algjörrar eyðingar á nauðsynlegu amínósýrunni tryptófan, auk þess sem metíónín, cystín og cystein tapast að hluta. (Pasupuleki & Braun, 2010). Á sama hátt leiðir basísk vatnsrof til algjörrar eyðingar flestra amínósýra, þó að tryptófan geti lifað af ósnortinn (Dai, et al., nítján og níutíu), (Hú, et al., 2017).
Í samanburði við súrt og basískt vatnsrof eru helstu kostir ensímvatnsrofs próteina:
- Vatnsrofsskilyrði eins og hitastig og pH eru væg og leiða ekki til neins þekkts taps á amínósýrum.
- Notkun próteasa ensíma er sértækari og nákvæmari við að stjórna umfangi vatnsrofs og stærð peptíða.
- Auðvelt er að slökkva á litlu magni af ensími sem notað er (td hita í 80 – 85ºC í að minnsta kosti 3 mínútur) til að stöðva vatnsrofsviðbrögðin. (Hú, et al., 2017).
Næringarfræðileg ávinningur af ensímvatnsrofnu próteini: próteinmeltanleiki og frásog.
Til viðbótar við próteinvatnsrofsaðferðina sem notuð er, eins og áður hefur verið lýst, er næringargildi próteinvatnsrofs háð samsetningu frjálsra amínósýra, lítilla peptíða (venjulega dí- og þrípeptíða) og stórra peptíða sem eru til staðar. Sögulega var talið að einungis frjálsar amínósýrur væru frásogaðar úr meltingarveginum af sérstökum amínósýruflutningsefnum. Þetta á sér stað, en nú er viðurkennt að meirihluti amínósýra frásogast sem tví- og þrípeptíð af breiðsértæka peptíðflutningstækinu PepT1 (Fei, et al., 1994). PepT1 getur hugsanlega flutt öll 400 dí-peptíð og 8,000 þrí-peptíð sem myndast við sameiningu 20 mismunandi amínósýra í mataræði (Daníel, 2004). Þess vegna má búast við að inntaka próteinvatnsrofs sem inniheldur hátt hlutfall af dí- og þrí-peptíðum myndi auðvelda meltingu og frásog próteina, sem myndi leiða til aukins meltanleika og aðgengis amínósýra.
Augljóslega er mikilvægt að koma á bestu ensím- og vatnsrofsskilyrðum til að geta búið til próteinvatnsrof með endanlegum peptíðstærðarsniðum sem óskað er eftir. Hægt er að ákvarða stærðardreifingu peptíðs með því að nota tækni sem kallast stærðarútilokunarskiljun. Stærðarútilokunarskiljun (SEC) er efnagreiningartækni þar sem blöndur sameinda (eins og próteina eða peptíða) uppleystar í lausn eru aðskildar eftir stærð þeirra (eins og lýst er á mynd 1).
Mynd 1. Einfalt yfirlit yfir aðskilnað sameinda af mismunandi stærð í lausn með stærð útilokunarskiljun (SEC). Lausninni er borið á súlu sem er pakkað með plastefni úr gljúpum kúlulaga perlum (gráum kúlum). Stórar sameindir (rauðir hringir) komast ekki inn í svitaholur (göt) perlnanna og fara því tiltölulega hratt niður um súluna og verða fyrst greindar. Minni sameindir innan sýnisins geta farið mismikið inn í svitaholurnar eftir stærð þeirra. „Meðalstórar“ sameindir (grænir hringir) munu geta farið inn í sumar perlur en ekki aðrar og munu því taka lengri tíma að fara í gegnum súluna, en minnstu sameindir (bláir hringir) munu geta farið inn í allar svitaholur og taka lengst í gegnum súluna.
aðferðir
Hráefni – Fersk sýni af kjúklingaskrokka, andarskrokk og laxagrind voru stærðarminnkuð, gerð einsleit í þykkt deig og fryst. Ný lambalifur var fryst í heilu lagi. Efnin voru send til Nofima, Ås, Noregi, fyrir próteingreiningu og greiningu.
Próteólýsa – Fyrir hvert hráefni (kjúklingur, önd, lax og lambakjöt) var 500 g sýni blandað saman við 990 ml af eimuðu vatni í glerhvarfaíláti og hrært við 300 snúninga á mínútu. Fyrir hvert hráefni voru þrjú mismunandi próteasasím prófuð í tveimur mismunandi styrkjum og tveimur tímapunktum sem leiddu til 48 vatnsrofssýni til greiningar.
Stærðarútilokunarskiljun – Mólþyngdardreifing vatnsleysanlegra próteinhluta vatnsrofanna var ákvörðuð með stærðarútilokunarskiljun með því að nota Shimadzu LC-20AT hágæða vökvaskiljun (HPLC) kerfi með ljósdíóða fylkisskynjara (SPD M20A) stillt á 214nm.
Innihald kollagenpeptíðs – Hýdroxýprólín er breytt amínósýra sem er aðallega bundin við kollagen. Hýdroxýprólíninnihald í próteinvatnsrofi er hægt að nota sem óbeinan mælikvarða á magn kollagen/kollagenpeptíða sem eru til staðar. Full amínósýrugreining (þar á meðal hýdroxýprólín) á hverju hráefni var framkvæmd af Nofima Biolab; auk þess var hýdroxýprólíninnihald ákvarðað á viðurkenndri rannsóknarstofu (ALS, Noregi) í vatnsleysanlegu broti vatnsrofanna.
Niðurstöður
Peptíðstærðardreifing vatnsrofsefna – Almennt, fyrir hvert ensím sem prófað var, leiddi ræktun hvers hráefnis með hærri styrk ensíms og í lengri tíma til „hagstæðs“ breytingu á peptíðstærðarsniði vatnsrofanna (þ.e. aukningu á hlutfalli smærri peptíða) ). Þetta er undirstrikað á mynd 2, sem sýnir niðurstöður fyrir hvert hráefni með því að nota „besta“ ensímið í „óákjósanlegum“ styrk og tímalengd samanborið við „ákjósanlegur“ styrkur og tímalengd. Með bjartsýni aðstæðum komumst við að því að 100% peptíða voru ≤3 kDa og meira en 75% voru <0.5 kDa (mynd 2).
Byggt á sameiginlegum sönnunargögnum nokkurra rannsókna á fjölda tegunda (td rottum, svínum, hundum, mönnum; sjá (Zhangi og Matthews, 2010) til yfirlits er almennt vel viðurkennt að:
- Frásog peptíða er betra miðað við ósnortið prótein.
- Frásog peptíða er betra en ókeypis amínósýrur.
- Frásog lítil peptíð er betri en stór peptíð.
Lífeðlisfræðilega frásogast meirihluti amínósýra sem lítil peptíð sem samanstanda af 2 eða 3 amínósýrum tengdum saman (dí- og þrípeptíð, í sömu röð). Þess vegna má búast við að inntaka próteinvatnsrofs sem inniheldur hátt hlutfall af dí- og þrí-peptíðum myndi auðvelda meltingu og frásog próteina, sem myndi leiða til aukins meltanleika og aðgengis amínósýra. Meðalmólþungi amínósýru er 110 Dalton (Da), þannig að dí- og þrípeptíð myndu hafa mólmassa um það bil 220-330 Da (0.2-0.3 kDa). Niðurstöður okkar við að ná fram vatnsrofi próteina með meira en 75% af peptíðum sem eru minni en 0.5 kDa (þ.e. allt að ~ 5 amínósýrur) þýðir að próteinið í kubbunum okkar væri mjög meltanlegt og frásogast auðveldlega af gæludýrunum sem borða það. Fyrirhugað er að sýna fram á þetta með fóðrunarrannsókn í samvinnu við Dýralæknadeild Háskólans í Gent.
Að auki, að ná 100% af peptíðum sem eru 3 kDa eða minni dregur úr hættu á að kalla fram ofnæmisviðbrögð við próteingjafanum og getur því talist ofnæmisvaldandi.
Mynd 2.
Stærðardreifing (kDa) peptíða í vatnsfasa vatnsrofsefna hvers hráefnis sem er ræktað með sama ensíminu við „óbjartsýni“ og „bjartsýni“ aðstæður hvað varðar styrk ensíma og lengd vatnsrofs. Athugaðu sérstaklega hvernig hlutfall peptíða á milli 1.0-3.0 kDa lækkar og peptíð <0.5 kDa eykst og færist úr „óbjartsýni“ yfir í „bjartsýni“ aðstæður.
Innihald kollagenpeptíðs
Fyrir hvert hráefni sem var prófað virkuðu ensím A og C almennt „betri“ (hvað varðar að endurheimta hærra hlutfall af hýdroxýprólíni í vatnsfasa vatnsrofanna) en ensím B þegar borið er saman tiltekinn lengd vatnsrofs og ensímstyrk (td. niðurstöður fyrir lax á mynd 3).
Þar sem „ósnortið“ kollagenprótein er ekki leysanlegt í vatni gefur tilvist hýdroxýprólíns (merki okkar „kollagens“) í vatnsfasanum til kynna að kollagenpróteinið hafi verið melt í kollagenpeptíð (sem eru vatnsleysanleg). Niðurstöður okkar sýna að við getum notað ensímpróteingreiningu til að búa til hráefni sem geta haft mögulegan hagnýtan ávinning eins og að styðja við heilbrigði liða, heilsu húðar og heilsu þarma með kollagenpeptíðunum sem eru til staðar í þeim.
MYND 3. Hlutfall hýdroxýprólíns (amínósýra sem finnst nánast eingöngu í kollageni) sem er endurheimt í vatnsfasa vatnsrofins lax með þremur mismunandi ensímum (A, B eða C) ræktað með hráefninu (laxi) í tveimur mismunandi styrkjum (C1 eða C2) fyrir tvö mismunandi tímabil (T1 eða T2).
Niðurstaða
Þessar jákvæðu niðurstöður gefa tækifæri til að öðlast aukið gildi frá náttúrulegri nærveru kollagens í tilteknum hráefnum með því að búa til kollagenpeptíð með möguleika á að skila hagnýtum ávinningi eins og að viðhalda heilbrigðum liðum hjá virkum gæludýrum og bæta hreyfanleika og sveigjanleika liða hjá eldri gæludýrum, t.d. dæmi.
Með háu hlutfalli (>75%) lítilla peptíða (<0.5kDa) sem framleitt er við „bjartsýni“ aðstæður byggðar á þessum rannsóknum, fyrsti hluti okkar HDP markmiði er náð. Næsta mikilvæga skrefið er að sýna fram á að matarbitar sem eru búnir til með þessu HDP eru í raun meltanlegri og lífaðgengilegri en núverandi nýlagaðar vörur okkar - við erum upptekin við að framkvæma þetta í fóðrunarrannsókn með Háskólinn í Gent Dýralæknaskóli. Fylgstu með þessu rými!
Meðmæli
- Cave, N., 2006. Vatnsrofið próteinfæði fyrir hunda og ketti. Veterinary Clinics Small Animal Practice, 36. bindi, bls. 1251-1268.
- Dai, Z., Wu, Z., Jia, S. & Wu, G., 2014. Greining á amínósýrusamsetningu í próteinum úr dýravef og matvælum sem o-phthaldialdehýð afleiður fyrir dálka með HPLC með flúrljómunargreiningu.. J Litskiljun B, bindi 964, bls. 116-127.
- Daniel, H., 2004. Molecular and integrative physiology of intestinal peptide transport.. Annual Review of Physiology, Volume 66, bls. 361-384.
- Fei, Y. o.fl., 1994. Tjáningaklónun spendýra róteindatengdrar fákeppnisflutninga.. Nature, Volume 7, bls. 563-566.
- Hanaoka, K. o.fl., 2019. Einkenni próteina og peptíða mólþunga við framleiðslu á gæludýrafóður. [Á netinu] Fáanlegt á: https://www.diana-petfood.com/emea-en/publications/
- Hou, Y. o.fl., 2017. Próteinhýdroysöt í fóðrun dýra: Iðnaðarframleiðsla, lífvirk peptíð og virkni. Journal of Animal Science and Biotechnology, bls. 24-36.
- Knights, R., 1985. Vinnsla og mat á próteinvatnsrofsefnum. Í: Næring fyrir sérþarfir. New York: Marcel Dekker, bls. 105-115.
- MINTEL, 2017. Meira gagnsæi hvað varðar prótein í gæludýrafóðri, sl: MINTEL REPORTS.
- Pasupuleki, VK, Braun, S, 2010. Nýjasta framleiðsla próteinavatnsrofsefna. Í: Protein Hydrolysates in Biotechnology. New York: Springer, bls. 11-32.
- Zhangi, B. & Matthews, J., 2010. Lífeðlisfræðilegt mikilvægi og aðferðir við frásog próteinvatnsrofs. Í: Protein Hydrolysates in Biotechnology. New York: Springer, bls. 135-177.