Desarrollo de un enfoque de hidrólisis de proteínas para aumentar los beneficios nutricionales de la carne y el pescado recién preparados.

Un artículo de apoyo científico del Dr. Adrian Hewson-Hughes | Asesora en Nutrición, Seguridad Alimentaria e Innovación, GA Pet Food Partners.

Introducción.

El contenido de proteína animal está bien establecido como la esencia de los alimentos de primera calidad para perros y gatos, y muchos dueños de mascotas reconocen que el adagio de "calidad sobre cantidad" se aplica aquí. Según la empresa de investigación de mercado Mintel, el 59 % de los dueños de gatos y el 57 % de los dueños de perros dicen que la calidad de la carne es más importante que el contenido total de carne en los alimentos para mascotas (MINTEL, 2017).

GA Pet Food Partners ha reconocido esto por mucho tiempo. Desde la introducción de Freshtrusion®, GA ha liderado el camino en el desarrollo y la fabricación de dietas que contienen cantidades cada vez mayores de fuentes de proteína de carne y pescado recién preparadas. Tanto las mascotas como sus dueños aprecian mucho los beneficios de usar fuentes de carne y pescado frescos en lugar de harinas de carne y pescado procesadas y secas, incluido un mejor sabor y una mayor digestibilidad.

Esforzarnos por ofrecer a nuestros socios productos aún mejores.

El mercado de alimentos para mascotas es muy dinámico y, si bien resaltar la alta proporción exacta de carne/pescado/aves en los productos es un acierto, esto se está convirtiendo en una expectativa básica en lugar de la calidad deseada para estos productos por parte de los dueños de mascotas. Aquí en GA, buscamos constantemente formas de ofrecer a los socios productos aún mejores, y es por eso que nos propusimos hacer lo que parecía imposible: idear una manera de cocinar nuestros ingredientes frescos de carne y pescado para hacerlos aún mejores para las mascotas. .

La idea es aumentar el valor nutricional de la proteína dentro de nuestros ingredientes frescos de carne y pescado al convertir la proteína en pequeños péptidos, que son absorbidos más fácilmente por las mascotas que la comen (lo llamamos 'HDP' - proteína altamente digerible). Para ayudarnos en esta búsqueda, identificamos expertos en Nofima, un instituto de investigación líder en investigación alimentaria aplicada con sede en Noruega, para optimizar las condiciones para la digestión enzimática de materias primas seleccionadas de carne y pescado y analizarlas para demostrar que podíamos lograr lo que queríamos. .

Digestión de proteínas, también conocida como proteólisis o hidrólisis

Las proteínas son moléculas grandes formadas por "bloques de construcción" individuales llamados aminoácidos. Después de comer alimentos que contienen proteínas, comienza el proceso de proteólisis a medida que las enzimas liberadas en diferentes partes del tracto gastrointestinal lo descomponen en aminoácidos y péptidos pequeños. Esto permite que estos componentes básicos sean absorbidos por el cuerpo, donde pueden recombinarse para construir nuevas proteínas (como músculos, piel, cabello, anticuerpos, enzimas, hormonas, etc.).

También es posible que las fuentes de proteínas se sometan a un proceso de proteólisis enzimática controlada como parte de su preparación para su inclusión en alimentos manufacturados y productos nutricionales. Por ejemplo, los hidrolizados de proteínas se han utilizado durante décadas en la nutrición humana, sobre todo en la producción de fórmulas de leche infantil hipoalergénicas para bebés/niños alérgicos a la proteína de la leche de vaca.

Hidrólisis Enzimática o Química

La hidrólisis de proteínas, la ruptura de los enlaces peptídicos que unen los aminoácidos mediante la adición de agua, se puede lograr por diferentes métodos: químicamente usando ácidos o bases (alcalina) o enzimáticamente (el enfoque en el que nos estamos enfocando). Si bien los métodos de hidrólisis ácida y alcalina de proteínas ofrecen la ventaja de su bajo costo, existen consecuencias negativas en cuanto a la calidad nutricional de los hidrolizados producidos. La hidrólisis ácida da como resultado la destrucción completa del aminoácido esencial triptófano, así como la pérdida parcial de metionina, cistina y cisteína. (Pasupuleki & Braun, 2010). De manera similar, la hidrólisis alcalina da como resultado la destrucción completa de la mayoría de los aminoácidos, aunque el triptófano puede sobrevivir intacto. (Di, et al., 2014), (Hola, et al., 2017).

En comparación con la hidrólisis ácida y alcalina, las principales ventajas de la hidrólisis enzimática de proteínas son:

  1. Las condiciones de hidrólisis, como la temperatura y el pH, son suaves y no dan como resultado ninguna pérdida conocida de aminoácidos.
  2. El uso de enzima(s) de proteasa es más específico y preciso para controlar el grado de hidrólisis y el tamaño de los péptidos.
  3. Las pequeñas cantidades de enzima utilizadas se pueden desactivar fácilmente (p. ej., calentando a 80 – 85 ºC durante al menos 3 minutos) para detener la reacción de hidrólisis. (Hola, et al., 2017).

Beneficios nutricionales de la proteína hidrolizada enzimáticamente: digestibilidad y absorción de la proteína.

Además del método de hidrólisis de proteínas utilizado, como se describió anteriormente, el valor nutricional de los hidrolizados de proteínas depende de la composición de aminoácidos libres, péptidos pequeños (típicamente dipéptidos y tripéptidos) y péptidos grandes presentes. Históricamente se creía que solo los aminoácidos libres eran absorbidos del tracto gastrointestinal por transportadores de aminoácidos específicos. Esto ocurre, pero ahora se reconoce que la mayoría de los aminoácidos son absorbidos como dipéptidos y tripéptidos por el transportador de péptidos de amplia especificidad PepT1. (fei, et al., 1994). PepT1 puede transportar potencialmente los 400 dipéptidos y los 8,000 tripéptidos que resultan de la combinación de los 20 aminoácidos dietéticos diferentes (Daniel, 2004). Por lo tanto, se esperaría que la ingestión de un hidrolizado de proteína que contenga altas proporciones de dipéptidos y tripéptidos facilitaría la digestión y absorción de proteínas, lo que resultaría en una mayor digestibilidad y biodisponibilidad de aminoácidos.

Claramente, establecer las mejores condiciones de enzima e hidrólisis es fundamental para poder crear hidrolizados de proteínas con los perfiles de tamaño de péptido finales deseados. La distribución del tamaño de los péptidos se puede determinar usando una técnica llamada cromatografía de exclusión por tamaño. La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) es una técnica de química analítica en la que las mezclas de moléculas (como proteínas o péptidos) disueltas en una solución se separan por su tamaño (como se describe en la figura 1).

FIGURA 1. Resumen simple de la separación de moléculas de diferentes tamaños en una solución por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). La solución se aplica a una columna que se rellena con una resina de perlas esféricas porosas (esferas grises). Las moléculas grandes (círculos rojos) no podrán entrar en los poros (agujeros) de las perlas y, por lo tanto, pasarán por la columna con relativa rapidez y se detectarán primero. Las moléculas más pequeñas dentro de la muestra pueden ingresar a los poros en diversos grados dependiendo de su tamaño. Las moléculas de "tamaño mediano" (círculos verdes) podrán entrar en algunas perlas pero no en otras, por lo que tardarán más en atravesar la columna, mientras que las moléculas más pequeñas (círculos azules) podrán entrar en todos los poros y tardarán el más largo en pasar a través de la columna.

Métodos

Materias primas – Muestras frescas de canales de pollo, canales de pato y marcos de salmón se redujeron de tamaño, se homogeneizaron en una pasta espesa y se congelaron. El hígado de cordero fresco se congeló entero. Los materiales fueron enviados a nófima, Ås, Noruega, para proteólisis y análisis.

Proteólisis – Para cada materia prima (pollo, pato, salmón y cordero), se mezcló una muestra de 500 g con 990 ml de agua destilada en un recipiente de reacción de vidrio y se agitó a 300 rpm. Para cada materia prima, se probaron tres enzimas de proteasa diferentes a dos concentraciones diferentes y dos puntos de tiempo, lo que resultó en 48 muestras de hidrolizado para el análisis.

Cromatografía de exclusión por tamaño – La distribución del peso molecular de la fracción de proteína soluble en agua de los hidrolizados se determinó mediante cromatografía de exclusión por tamaño utilizando un sistema de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) Shimadzu LC-20AT con un detector de matriz de fotodiodos (SPD M20A) ajustado a 214 nm.

Contenido de péptido de colágeno – La hidroxiprolina es un aminoácido modificado, cuya presencia se limita principalmente al colágeno. El contenido de hidroxiprolina en los hidrolizados de proteínas se puede utilizar como medida indirecta de la cantidad de colágeno/péptidos de colágeno presentes. Nofima Biolab llevó a cabo un análisis completo de aminoácidos (incluida la hidroxiprolina) de cada materia prima; además, se determinó el contenido de hidroxiprolina en un laboratorio acreditado (ALS, Noruega) en la fracción hidrosoluble de los hidrolizados.

Resultados

Distribución del tamaño de péptidos de hidrolizados – En general, para cada enzima analizada, la incubación de cada materia prima con la mayor concentración de enzima y durante más tiempo resultó en un cambio 'beneficioso' en el perfil de tamaño de péptido de los hidrolizados (es decir, un aumento en la proporción de péptidos más pequeños ). Esto se destaca en la Figura 2, que muestra los resultados de cada materia prima utilizando la enzima 'mejor' a una concentración y duración 'no óptima' en comparación con la concentración y duración 'óptimas'. Con condiciones optimizadas, encontramos que el 100 % de los péptidos eran ≤3 kDa y más del 75 % eran <0.5 kDa (Figura 2).

Basado en la evidencia colectiva de varios estudios en varias especies (por ejemplo, rata, cerdo, perro, humano; ver (Zhangi y Matthews, 2010) para una visión general, generalmente se acepta que:

  • La absorción de péptidos es mejor en comparación con la proteína intacta.
  • La absorción de péptidos es mejor que la de los aminoácidos libres.
  • La absorción de péptidos pequeños es mejor que la de péptidos grandes.

Fisiológicamente, la mayoría de los aminoácidos se absorben como pequeños péptidos que consisten en 2 o 3 aminoácidos unidos (di- y tri-péptidos, respectivamente). Por lo tanto, se esperaría que la ingestión de un hidrolizado de proteína que contenga altas proporciones de dipéptidos y tripéptidos facilitaría la digestión y absorción de proteínas, lo que resultaría en una mayor digestibilidad y biodisponibilidad de aminoácidos. El peso molecular medio de un aminoácido es de 110 Dalton (Da), por lo que los dipéptidos y tripéptidos tendrían un peso molecular de aproximadamente 220-330 Da (0.2-0.3 kDa). Nuestros resultados en lograr hidrolizados de proteínas con más del 75 % de péptidos menores de 0.5 kDa (es decir, hasta ~ 5 aminoácidos) significa que la proteína en nuestras croquetas sería altamente digerible y fácilmente absorbida por las mascotas que la comen. Está previsto demostrar esto a través de un estudio de alimentación en colaboración con la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Gante.

Además, lograr el 100 % de péptidos de 3 kDa o menos disminuye el riesgo de desencadenar una reacción alérgica a las fuentes de proteínas y, por lo tanto, puede considerarse hipoalergénico.

Figura 2.

Distribución de tamaño (kDa) de péptidos en la fase acuosa de hidrolizados de cada materia prima incubados con la misma enzima en condiciones "no optimizadas" y "optimizadas" en términos de concentración de enzima y duración de la hidrólisis. Obsérvese en particular cómo disminuye el porcentaje de péptidos entre 1.0 y 3.0 kDa y aumenta el de péptidos <0.5 kDa, pasando de condiciones "no optimizadas" a "optimizadas".

Pato (no optimizado)

Pato (optimizado)

Salmón (no optimizado)

Salmón (optimizado)

Pollo (no optimizado)

Pollo (optimizado)

Cordero (no optimizado)

Cordero (optimizado)

Contenido de péptido de colágeno

Para cada materia prima analizada, las enzimas A y C funcionaron 'mejor' en general (en términos de recuperar un mayor porcentaje de hidroxiprolina en la fase acuosa de los hidrolizados) que la enzima B cuando se compara una duración dada de hidrólisis y concentración de enzima (por ejemplo, ver resultados para el salmón en la figura 3).

Dado que la proteína de colágeno 'intacta' no es soluble en agua, la presencia de hidroxiprolina (nuestro marcador de 'colágeno') en la fase acuosa indica que la proteína de colágeno ha sido digerida en péptidos de colágeno (que son solubles en agua). Nuestros resultados ilustran que podemos usar la proteólisis enzimática para crear materias primas que pueden brindar beneficios funcionales potenciales, como apoyar la salud de las articulaciones, la salud de la piel y la salud intestinal a través de los péptidos de colágeno presentes en ellos.

FIGURA 3. Porcentaje de hidroxiprolina (un aminoácido que se encuentra casi exclusivamente en el colágeno) recuperada en la fase acuosa de salmón hidrolizado con tres enzimas diferentes (A, B o C) incubadas con la materia prima (salmón) a dos concentraciones diferentes (C1 o C2) para dos periodos de tiempo diferentes (T1 o T2).

Conclusión

Estos resultados positivos presentan oportunidades para obtener un valor adicional de la presencia natural de colágeno dentro de ciertas materias primas mediante la creación de péptidos de colágeno con el potencial de brindar beneficios funcionales, como mantener las articulaciones saludables en mascotas activas y mejorar la movilidad y flexibilidad de las articulaciones en mascotas mayores, para ejemplo.

Con el alto porcentaje (>75 %) de péptidos pequeños (<0.5 kDa) producidos en condiciones 'optimizadas' basadas en esta investigación, la primera parte de nuestro HDP se logra el objetivo. El próximo paso importante es demostrar que las croquetas hechas con este HDP son más digeribles y biodisponibles que nuestros productos recién preparados existentes; estamos ocupados realizando esto en un estudio de alimentación con el Universidad de Gante Escuela de veterinaria. ¡Mira este espacio!

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Referencias

  1. Cave, N., 2006. Dietas de proteínas hidrolizadas para perros y gatos. Veterinary Clinics Small Animal Practice, Volumen 36, págs. 1251-1268.
  2. Dai, Z., Wu, Z., Jia, S. & Wu, G., 2014. Análisis de la composición de aminoácidos en proteínas de tejidos animales y alimentos como derivados de o-ftaldialdehído precolumna por HPLC con detección de fluorescencia. J Chromatography B, volumen 964, págs. 116-127.
  3. Daniel, H., 2004. Fisiología molecular e integradora del transporte de péptidos intestinales. Revisión anual de fisiología, volumen 66, págs. 361-384.
  4. Fei, Y. et al., 1994. Clonación de expresión de un transportador de oligopéptidos acoplados a protones de mamíferos. Nature, volumen 7, págs. 563-566.
  5. Hanaoka, K. et al., 2019. Caracterización del peso molecular de proteínas y péptidos durante la fabricación de palatantes de alimentos para mascotas. [En línea] Disponible en: https://www.diana-petfood.com/emea-en/publications/
  6. Hou, Y. et al., 2017. Hidrolizados de proteínas en nutrición animal: producción industrial, péptidos bioactivos y significado funcional. Revista de Ciencia Animal y Biotecnología, pp. 24-36.
  7. Knights, R., 1985. Procesamiento y evaluación de hidrolizados de proteínas. En: Nutrición para Necesidades Especiales. Nueva York: Marcel Dekker, págs. 105-115.
  8. MINTEL, 2017. Mayor transparencia en materia de proteína en alimentos para mascotas, sl: INFORMES MINTEL.
  9. Pasupuleki, VK, Braun, S, 2010. Fabricación de hidrolizados de proteínas de última generación. En: Hidrolizados de Proteínas en Biotecnología. Nueva York: Springer, págs. 11-32.
  10. Zhangi, B. & Matthews, J., 2010. Importancia fisiológica y mecanismos de absorción de hidrolizados de proteínas. En: Hidrolizados de Proteínas en Biotecnología. Nueva York: Springer, págs. 135-177.