Ανάπτυξη προσέγγισης υδρόλυσης πρωτεϊνών για την αύξηση των διατροφικών πλεονεκτημάτων του φρέσκου κρέατος και των ψαριών.
Μια επιστημονική εργασία υποστήριξης από τον Dr Adrian Hewson-Hughes | Σύμβουλος Διατροφής, Ασφάλειας Τροφίμων και Καινοτομίας, GA Pet Food Partners.
Εισαγωγή.
Η περιεκτικότητα σε ζωικές πρωτεΐνες είναι καλά τεκμηριωμένη ως η ουσία των τροφών υψηλής ποιότητας για σκύλους και γάτες και πολλοί ιδιοκτήτες κατοικίδιων αναγνωρίζουν ότι εδώ ισχύει το ρητό «ποιότητα πάνω από ποσότητα». Σύμφωνα με την εταιρεία ερευνών αγοράς Mintel, το 59% των ιδιοκτητών γατών και το 57% των ιδιοκτητών σκύλων λένε ότι η ποιότητα του κρέατος είναι πιο σημαντική από τη συνολική περιεκτικότητα σε κρέας στις τροφές για κατοικίδια (MINTEL, 2017).
GA Pet Food Partners το έχει αναγνωρίσει εδώ και καιρό. Από την εισαγωγή του Freshtrusion®, η GA έχει πρωτοστατήσει στην ανάπτυξη και την κατασκευή δίαιτων που περιέχουν αυξανόμενες ποσότητες φρέσκων πηγών πρωτεΐνης κρέατος και ψαριού. Τα οφέλη από τη χρήση πηγών φρέσκου κρέατος και ψαριών σε σχέση με τα αποξηραμένα, τετηγμένα γεύματα κρέατος και ψαριών, συμπεριλαμβανομένης της καλύτερης γεύσης και της αυξημένης πεπτικότητας, εκτιμώνται καλά τόσο από τα κατοικίδια όσο και από τους ιδιοκτήτες τους.
Προσπαθούμε να προσφέρουμε στους Συνεργάτες μας ακόμα καλύτερα προϊόντα.
Η αγορά τροφών για κατοικίδια είναι πολύ δυναμική και ενώ η επισήμανση του ακριβούς υψηλού ποσοστού κρέατος/ψαριού/πουλερικού στα προϊόντα είναι μια σοφή κίνηση, αυτό γίνεται μια βασική προσδοκία και όχι η επιθυμητή ποιότητα για αυτά τα προϊόντα από τους ιδιοκτήτες κατοικίδιων ζώων. Εδώ στο GA, προσπαθούμε συνεχώς να βρούμε τρόπους να προσφέρουμε στους Συνεργάτες ακόμα καλύτερα προϊόντα, και αυτός είναι ο λόγος για τον οποίο ξεκινήσαμε να κάνουμε το φαινομενικά αδύνατο - να βρούμε έναν τρόπο να μαγειρέψουμε τα φρέσκα συστατικά του κρέατος και των ψαριών μας για να τα κάνουμε ακόμα καλύτερα για τα κατοικίδια .
Η ιδέα είναι να αυξήσουμε τη θρεπτική αξία της πρωτεΐνης στα συστατικά του φρέσκου κρέατος και των ψαριών μας, μετατρέποντας την πρωτεΐνη σε μικρά πεπτίδια, τα οποία απορροφώνται πιο εύκολα από τα κατοικίδια που την τρώνε (την ονομάζουμε «HDP» – Πρωτεΐνη Υψηλής Πέψης). Για να μας βοηθήσουν σε αυτήν την αναζήτηση, εντοπίσαμε ειδικούς στο Nofima, ένα κορυφαίο ερευνητικό ινστιτούτο για την εφαρμοσμένη έρευνα τροφίμων στη Νορβηγία, για τη βελτιστοποίηση των συνθηκών για την ενζυματική πέψη επιλεγμένων πρώτων υλών κρέατος και ψαριών και την ανάλυση τους για να δείξουμε ότι μπορούσαμε να πετύχουμε αυτό που θέλαμε .
Πέψη πρωτεϊνών - γνωστή και ως Πρωτεόλυση ή Υδρόλυση
Οι πρωτεΐνες είναι μεγάλα μόρια που αποτελούνται από μεμονωμένα «δομικά στοιχεία» που ονομάζονται αμινοξέα. Μετά την κατανάλωση τροφής που περιέχει πρωτεΐνη, η διαδικασία της πρωτεόλυσης ξεκινά καθώς τα ένζυμα που απελευθερώνονται σε διάφορα μέρη του γαστρεντερικού σωλήνα τη διασπούν σε αμινοξέα και μικρά πεπτίδια. Αυτό επιτρέπει σε αυτά τα δομικά στοιχεία να απορροφηθούν στο σώμα, όπου μπορούν να ανασυνδυαστούν για να δημιουργηθούν νέες πρωτεΐνες (όπως μυς, δέρμα, μαλλιά, αντισώματα, ένζυμα, ορμόνες κ.λπ.).
Είναι επίσης δυνατό για τις πηγές πρωτεΐνης να υποβληθούν σε μια ελεγχόμενη ενζυματική διαδικασία πρωτεόλυσης ως μέρος της προετοιμασίας τους για συμπερίληψη σε βιομηχανικά τρόφιμα και διατροφικά προϊόντα. Για παράδειγμα, τα προϊόντα υδρόλυσης πρωτεϊνών χρησιμοποιούνται για δεκαετίες στην ανθρώπινη διατροφή, κυρίως στην παραγωγή υποαλλεργικών σκευασμάτων βρεφικού γάλακτος για μωρά/παιδιά αλλεργικά στην πρωτεΐνη αγελαδινού γάλακτος.
Ενζυματική ή Χημική Υδρόλυση
Η υδρόλυση πρωτεϊνών - η διάσπαση των πεπτιδικών δεσμών που ενώνουν τα αμινοξέα μεταξύ τους μέσω της προσθήκης νερού - μπορεί να επιτευχθεί με διάφορες μεθόδους: χημικά χρησιμοποιώντας οξέα ή βάσεις (αλκαλικές) ή ενζυματικά (η προσέγγιση στην οποία εστιάζουμε). Ενώ οι μέθοδοι όξινης και αλκαλικής υδρόλυσης πρωτεϊνών προσφέρουν το πλεονέκτημα του χαμηλού κόστους, υπάρχουν αρνητικές συνέπειες όσον αφορά τη θρεπτική ποιότητα των παραγόμενων υδρολύσεων. Η όξινη υδρόλυση έχει ως αποτέλεσμα την πλήρη καταστροφή του βασικού αμινοξέος τρυπτοφάνη, καθώς και μερική απώλεια μεθειονίνης, κυστίνης και κυστεΐνης (Pasupuleki & Braun, 2010). Ομοίως, η αλκαλική υδρόλυση έχει ως αποτέλεσμα την πλήρη καταστροφή των περισσότερων αμινοξέων, αν και η τρυπτοφάνη μπορεί να επιβιώσει ανέπαφη (Ντάι, et αϊ., 2014), (Χαου, et αϊ., 2017).
Σε σύγκριση με την όξινη και αλκαλική υδρόλυση, τα κύρια πλεονεκτήματα της ενζυματικής υδρόλυσης πρωτεϊνών είναι:
- Οι συνθήκες υδρόλυσης όπως η θερμοκρασία και το pH είναι ήπιες και δεν οδηγούν σε καμία γνωστή απώλεια αμινοξέων.
- Η χρήση ενζύμου(ων) πρωτεάσης είναι πιο ειδική και ακριβής στον έλεγχο της έκτασης της υδρόλυσης και του μεγέθους των πεπτιδίων.
- Οι μικρές ποσότητες ενζύμου που χρησιμοποιούνται μπορούν εύκολα να απενεργοποιηθούν (π.χ. θέρμανση στους 80 – 85ºC για τουλάχιστον 3 λεπτά) για να σταματήσει η αντίδραση υδρόλυσης. (Χαου, et αϊ., 2017).
Διατροφικά οφέλη της ενζυμικά υδρολυμένης πρωτεΐνης: πεπτικότητα και απορρόφηση πρωτεΐνης.
Εκτός από τη μέθοδο υδρόλυσης πρωτεϊνών που χρησιμοποιείται, όπως υπογραμμίστηκε προηγουμένως, η θρεπτική αξία των προϊόντων υδρόλυσης πρωτεΐνης εξαρτάται από τη σύνθεση ελεύθερων αμινοξέων, μικρών πεπτιδίων (συνήθως δι- και τρι-πεπτιδίων) και μεγάλων πεπτιδίων που υπάρχουν. Ιστορικά πιστεύεται ότι μόνο τα ελεύθερα αμινοξέα απορροφώνται από τη γαστρεντερική οδό από συγκεκριμένους μεταφορείς αμινοξέων. Αυτό συμβαίνει, αλλά τώρα αναγνωρίζεται ότι η πλειονότητα των αμινοξέων απορροφάται ως δι- και τρι-πεπτίδια από τον πεπτιδικό μεταφορέα ευρείας ειδικότητας PepT1 (Φέι, et αϊ., 1994). Το PepT1 μπορεί δυνητικά να μεταφέρει και τα 400 διπεπτίδια και τα 8,000 τριπεπτίδια που προκύπτουν από το συνδυασμό των 20 διαφορετικών διατροφικών αμινοξέων (Daniel, 2004). Ως εκ τούτου, θα αναμενόταν ότι η κατάποση ενός προϊόντος υδρόλυσης πρωτεΐνης που περιέχει υψηλές αναλογίες δι- και τρι-πεπτιδίων θα διευκόλυνε την πέψη και την απορρόφηση των πρωτεϊνών, με αποτέλεσμα αυξημένη πεπτικότητα και βιοδιαθεσιμότητα αμινοξέων.
Σαφώς, η δημιουργία των καλύτερων συνθηκών ενζύμου και υδρόλυσης είναι κρίσιμη για να μπορέσουμε να δημιουργήσουμε προϊόντα υδρόλυσης πρωτεΐνης με τα επιθυμητά προφίλ τελικού μεγέθους πεπτιδίου. Η κατανομή μεγέθους πεπτιδίου μπορεί να προσδιοριστεί χρησιμοποιώντας μια τεχνική που ονομάζεται χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους. Η χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους (SEC) είναι μια τεχνική αναλυτικής χημείας στην οποία μίγματα μορίων (όπως πρωτεΐνες ή πεπτίδια) διαλυμένα σε ένα διάλυμα διαχωρίζονται με το μέγεθός τους (όπως περιγράφεται στο σχήμα 1).
ΣΧΗΜΑ 1. Απλή επισκόπηση του διαχωρισμού μορίων διαφορετικών μεγεθών σε διάλυμα με χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους (SEC). Το διάλυμα εφαρμόζεται σε μια στήλη η οποία είναι γεμάτη με μια ρητίνη από πορώδη σφαιρικά σφαιρίδια (γκρίζες σφαίρες). Τα μεγάλα μόρια (κόκκινοι κύκλοι) δεν θα μπορούν να εισέλθουν στους πόρους (τρύπες) των σφαιριδίων και επομένως θα περάσουν από τη στήλη σχετικά γρήγορα και θα ανιχνευθούν πρώτα. Μικρότερα μόρια μέσα στο δείγμα μπορούν να εισέλθουν στους πόρους σε διάφορους βαθμούς ανάλογα με το μέγεθός τους. Τα «μεσαίου μεγέθους» μόρια (πράσινοι κύκλοι) θα μπορούν να εισέλθουν σε μερικά σφαιρίδια αλλά όχι σε άλλα και έτσι θα χρειαστεί περισσότερος χρόνος για να περάσουν από τη στήλη, ενώ τα μικρότερα μόρια (μπλε κύκλοι) θα μπορούν να εισέλθουν σε όλους τους πόρους και θα περάσουν το μεγαλύτερο για να περάσει από τη στήλη.
Μέθοδοι
πρώτες ύλες – Τα φρέσκα δείγματα από σφάγιο κοτόπουλου, σφάγιο πάπιας και κορνίζες σολομού μειώθηκαν σε μέγεθος, ομογενοποιήθηκαν σε παχύρρευστη πάστα και καταψύχθηκαν. Το φρέσκο συκώτι αρνιού ήταν κατεψυγμένο ολόκληρο. Τα υλικά στάλθηκαν στο Νοφίμα, Ås, Νορβηγία, για πρωτεόλυση και ανάλυση.
Πρωτεόλυση – Για κάθε πρώτη ύλη (κοτόπουλο, πάπια, σολομός και αρνί), ένα δείγμα 500 g αναμειγνύεται με 990 ml απεσταγμένου νερού σε γυάλινο δοχείο αντίδρασης και αναδεύεται στις 300 rpm. Για κάθε πρώτη ύλη, δοκιμάστηκαν τρία διαφορετικά ένζυμα πρωτεάσης σε δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις και δύο χρονικά σημεία με αποτέλεσμα 48 δείγματα υδρόλυσης για ανάλυση.
Χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους – Η κατανομή μοριακού βάρους του υδατοδιαλυτού κλάσματος πρωτεΐνης των υδρολυμάτων προσδιορίστηκε με χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους χρησιμοποιώντας ένα σύστημα υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης Shimadzu LC-20AT (HPLC) με ανιχνευτή διάταξης φωτοδιόδου (SPD M20A) στα 214 nm.
Περιεκτικότητα σε πεπτίδιο κολλαγόνου – Η υδροξυπρολίνη είναι ένα τροποποιημένο αμινοξύ, η παρουσία του οποίου περιορίζεται κυρίως στο κολλαγόνο. Η περιεκτικότητα σε υδροξυπρολίνη σε πρωτεϊνικά υδρολύματα μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως έμμεσο μέτρο της ποσότητας πεπτιδίων κολλαγόνου/κολλαγόνου που υπάρχουν. Μια πλήρης ανάλυση αμινοξέων (συμπεριλαμβανομένης της υδροξυπρολίνης) κάθε πρώτης ύλης πραγματοποιήθηκε από το Nofima Biolab. Επιπλέον, η περιεκτικότητα σε υδροξυπρολίνη προσδιορίστηκε σε ένα διαπιστευμένο εργαστήριο (ALS, Νορβηγία) στο υδατοδιαλυτό κλάσμα των υδρολυμάτων.
Αποτελέσματα
Κατανομή μεγέθους πεπτιδίου των υδρολυμάτων – Γενικά, για κάθε ένζυμο που δοκιμάστηκε, η επώαση κάθε πρώτης ύλης με την υψηλότερη συγκέντρωση ενζύμου και για μεγαλύτερη διάρκεια είχε ως αποτέλεσμα μια «ευεργετική» μετατόπιση στο προφίλ μεγέθους πεπτιδίου των υδρολυμάτων (δηλ. αύξηση της αναλογίας μικρότερων πεπτιδίων ). Αυτό τονίζεται στο Σχήμα 2, το οποίο δείχνει αποτελέσματα για κάθε πρώτη ύλη χρησιμοποιώντας το «καλύτερο» ένζυμο σε «μη βέλτιστη» συγκέντρωση και διάρκεια σε σύγκριση με τη «βέλτιστη» συγκέντρωση και διάρκεια. Με βελτιστοποιημένες συνθήκες, βρήκαμε ότι το 100% των πεπτιδίων ήταν ≤3 kDa και περισσότερο από το 75% ήταν < 0.5 kDa (Εικόνα 2).
Με βάση τα συλλογικά στοιχεία πολλών μελετών σε διάφορα είδη (π.χ. αρουραίος, χοίρος, σκύλος, άνθρωπος, βλ. (Zhangi & Matthews, 2010) για μια επισκόπηση, είναι γενικά αποδεκτό ότι:
- Η απορρόφηση των πεπτιδίων είναι καλύτερη σε σύγκριση με την άθικτη πρωτεΐνη.
- Η απορρόφηση των πεπτιδίων είναι καλύτερη από τα ελεύθερα αμινοξέα.
- Η απορρόφηση των μικρών πεπτιδίων είναι καλύτερη από τα μεγάλα πεπτίδια.
Φυσιολογικά, η πλειονότητα των αμινοξέων απορροφάται ως μικρά πεπτίδια που αποτελούνται από 2 ή 3 αμινοξέα ενωμένα μεταξύ τους (δι- και τρι-πεπτίδια, αντίστοιχα). Ως εκ τούτου, θα αναμενόταν ότι η κατάποση ενός προϊόντος υδρόλυσης πρωτεΐνης που περιέχει υψηλές αναλογίες δι- και τρι-πεπτιδίων θα διευκόλυνε την πέψη και την απορρόφηση των πρωτεϊνών, με αποτέλεσμα αυξημένη πεπτικότητα και βιοδιαθεσιμότητα αμινοξέων. Το μέσο μοριακό βάρος ενός αμινοξέος είναι 110 Daltons (Da), επομένως τα δι- και τρι-πεπτίδια θα έχουν μοριακό βάρος περίπου 220-330 Da (0.2-0.3 kDa). Τα αποτελέσματά μας στην επίτευξη πρωτεϊνικών υδρολύσεων με περισσότερο από 75% πεπτιδίων μικρότερα από 0.5 kDa (δηλαδή έως ~ 5 αμινοξέα) σημαίνει ότι η πρωτεΐνη στις κροκέτες μας θα είναι ιδιαίτερα εύπεπτη και θα απορροφάται εύκολα από τα κατοικίδια που την τρώνε. Σχεδιάζεται να αποδειχθεί αυτό μέσω μιας μελέτης σίτισης σε συνεργασία με τη Σχολή Κτηνιατρικής του Πανεπιστημίου της Γάνδης.
Επιπλέον, η επίτευξη 100% πεπτιδίων 3 kDa ή μικρότερης μειώνει τον κίνδυνο πρόκλησης αλλεργικής αντίδρασης στις πηγές πρωτεΐνης και επομένως μπορεί να θεωρηθεί υποαλλεργικό.
Εικόνα 2.
Κατανομή μεγέθους (kDa) των πεπτιδίων στην υδατική φάση των προϊόντων υδρόλυσης κάθε πρώτης ύλης που επωάστηκε με το ίδιο ένζυμο υπό «μη βελτιστοποιημένες» και «βελτιστοποιημένες» συνθήκες όσον αφορά τη συγκέντρωση του ενζύμου και τη διάρκεια της υδρόλυσης. Σημειώστε συγκεκριμένα πώς το ποσοστό των πεπτιδίων μεταξύ 1.0-3.0 kDa μειώνεται και τα πεπτίδια <0.5 kDa αυξάνονται, μεταβαίνοντας από «μη βελτιστοποιημένες» σε «βελτιστοποιημένες» συνθήκες.
Περιεκτικότητα σε πεπτίδιο κολλαγόνου
Για κάθε πρώτη ύλη που δοκιμάστηκε, τα ένζυμα Α και Γ είχαν «καλύτερη απόδοση» γενικά (όσον αφορά την ανάκτηση μεγαλύτερου ποσοστού υδροξυπρολίνης στην υδατική φάση των υδρολυμάτων) από το ένζυμο Β όταν συγκρίνουν μια δεδομένη διάρκεια υδρόλυσης και συγκέντρωση ενζύμου (π.χ. αποτελέσματα για τον σολομό στο σχήμα 3).
Εφόσον η «άθικτη» πρωτεΐνη κολλαγόνου δεν είναι διαλυτή στο νερό, η παρουσία υδροξυπρολίνης (ο δείκτης «κολλαγόνου» μας) στην υδατική φάση υποδηλώνει ότι η πρωτεΐνη κολλαγόνου έχει χωνευτεί σε πεπτίδια κολλαγόνου (τα οποία είναι υδατοδιαλυτά). Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι είμαστε σε θέση να χρησιμοποιήσουμε ενζυματική πρωτεόλυση για να δημιουργήσουμε πρώτες ύλες που είναι σε θέση να αποφέρουν πιθανά λειτουργικά οφέλη, όπως η υποστήριξη της υγείας των αρθρώσεων, της υγείας του δέρματος και της υγείας του εντέρου μέσω των πεπτιδίων κολλαγόνου που υπάρχουν μέσα τους.
ΕΙΚΟΝΑ 3. Ποσοστό υδροξυπρολίνης (ένα αμινοξύ που βρίσκεται σχεδόν αποκλειστικά στο κολλαγόνο) που ανακτάται στην υδατική φάση του υδρολυμένου σολομού με τρία διαφορετικά ένζυμα (Α, Β ή Γ) που επωάζονται με την πρώτη ύλη (σολομό) σε δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις (C1 ή C2) για δύο διαφορετικές χρονικές περιόδους (T1 ή T2).
Συμπέρασμα
Αυτά τα θετικά αποτελέσματα παρουσιάζουν ευκαιρίες για να αποκτήσετε επιπλέον αξία από τη φυσική παρουσία κολλαγόνου σε ορισμένες πρώτες ύλες, δημιουργώντας πεπτίδια κολλαγόνου με τη δυνατότητα να προσφέρουν λειτουργικά οφέλη, όπως η διατήρηση υγιών αρθρώσεων σε ενεργά κατοικίδια και η βελτίωση της κινητικότητας και της ευελιξίας των αρθρώσεων σε μεγαλύτερα κατοικίδια. παράδειγμα.
Με το υψηλό ποσοστό (>75%) μικρών πεπτιδίων (<0.5kDa) που παράγονται υπό «βελτιστοποιημένες» συνθήκες με βάση αυτή την έρευνα, το πρώτο μέρος της HDP ο στόχος επιτυγχάνεται. Το επόμενο σημαντικό βήμα είναι να αποδείξουμε ότι οι κροκέτες που κατασκευάζονται με αυτό το HDP είναι πράγματι πιο εύπεπτο και βιοδιαθέσιμο από τα υπάρχοντα φρεσκοπαρασκευασμένα προϊόντα μας – είμαστε απασχολημένοι με την εκτέλεση αυτού σε μια μελέτη σίτισης με το Πανεπιστήμιο της Γάνδης Κτηνιατρική σχολή. Παρακολουθήστε αυτόν τον χώρο!
αναφορές
- Cave, N., 2006. Δίαιτες υδρολυμένων πρωτεϊνών για σκύλους και γάτες. Veterinary Clinics Small Animal Practice, Τόμος 36, σελ. 1251-1268.
- Dai, Z., Wu, Z., Jia, S. & Wu, G., 2014. Ανάλυση της σύνθεσης αμινοξέων σε πρωτεΐνες ζωικών ιστών και τροφών ως παράγωγα ο-φθαλδιαλδεΰδης προ-στήλης με HPLC με ανίχνευση φθορισμού.. J Χρωματογραφία Β, Τόμος 964, σσ. 116-127.
- Daniel, H., 2004. Molecular and integrative physiology of intestinal peptide transport.. Annual Review of Physiology, Volume 66, σελ. 361-384.
- Fei, Υ. et al., 1994. Έκφραση κλωνοποίηση ενός θηλαστικού-συζευγμένου με πρωτόνιο ολιγοπεπτιδικό μεταφορέα. Nature, Τόμος 7, σελ. 563-566.
- Hanaoka, K. et al., 2019. Χαρακτηρισμός μοριακού βάρους πρωτεϊνών και πεπτιδίων κατά την κατασκευή τροφών για ζώα συντροφιάς. [Διαδικτυακός] Διαθέσιμο στη διεύθυνση: https://www.diana-petfood.com/emea-en/publications/
- Hou, Y. et al., 2017. Πρωτεϊνικά υδρολύματα στη διατροφή των ζώων: Βιομηχανική παραγωγή, βιοενεργά πεπτίδια και λειτουργική σημασία. Journal of Animal Science and Biotechnology, σελ. 24-36.
- Knights, R., 1985. Επεξεργασία και αξιολόγηση πρωτεϊνικών υδρολύσεων. Στο: Διατροφή για Ειδικές Ανάγκες. Νέα Υόρκη: Marcel Dekker, σ. 105-115.
- MINTEL, 2017. Μεγαλύτερη διαφάνεια όσον αφορά την πρωτεΐνη στις τροφές για κατοικίδια, sl: MINTEL REPORTS.
- Pasupuleki, VK, Braun, S, 2010. Σύγχρονη κατασκευή προϊόντων υδρόλυσης πρωτεϊνών. Στο: Protein Hydrolysates in Biotechnology. New York: Springer, σσ. 11-32.
- Zhangi, B. & Matthews, J., 2010. Φυσιολογική σημασία και μηχανισμοί απορρόφησης πρωτεϊνών υδρόλυσης. Στο: Protein Hydrolysates in Biotechnology. New York: Springer, σσ. 135-177.