Udvikling af proteinhydrolysetilgang til at øge de ernæringsmæssige fordele ved frisklavet kød og fisk.
Et videnskabeligt støttepapir af Dr. Adrian Hewson-Hughes | Ernærings-, fødevaresikkerheds- og innovationsrådgiver, GA Pet Food Partners.
Indledning.
Det animalske proteinindhold er veletableret som essensen af premium kvalitetsfoder til hunde og katte, og mange kæledyrsejere erkender, at ordsproget "kvalitet frem for kvantitet" gælder her. Ifølge markedsundersøgelsesfirmaet Mintel siger 59 % af katteejere og 57 % af hundeejere, at kvaliteten af kød er vigtigere end det samlede kødindhold i foder til kæledyr (MINTEL, 2017).
GA Pet Food Partners har længe erkendt dette. Siden indførelsen af Freshtrusion®, GA har ført an i udvikling og fremstilling af diæter, der indeholder stigende mængder af frisklavet kød og fiskeproteinkilder. Fordelene ved at bruge friske kød- og fiskekilder fremfor tørrede, udsmeltede kød- og fiskemåltider, herunder bedre smag og øget fordøjelighed, er godt værdsat af både kæledyr og deres ejere.
Stræber efter at tilbyde vores partnere endnu bedre produkter.
Markedet for kæledyrsfoder er meget dynamisk, og selvom det er et klogt træk at fremhæve den nøjagtige høje andel af kød/fisk/fjerkræ i produkter, er dette ved at blive en grundlæggende forventning snarere end den ønskede kvalitet for disse produkter fra kæledyrsejere. Her hos GA stræber vi konstant efter måder at tilbyde partnere endnu bedre produkter, og det er derfor, vi sætter os for at gøre det tilsyneladende umulige – finde på en måde at tilberede vores friske kød- og fiskeingredienser for at gøre dem endnu bedre til kæledyr .
Ideen er at øge næringsværdien af proteinet i vores friske kød- og fiskeingredienser ved at omdanne proteinet til små peptider, som lettere absorberes af kæledyrene, der spiser det (vi kalder det 'HDP' – Highly Digestible Protein). For at hjælpe os i denne søgen har vi identificeret eksperter hos Nofima, et førende forskningsinstitut for anvendt fødevareforskning baseret i Norge, for at optimere betingelserne for enzymatisk fordøjelse af udvalgte kød- og fiskeråvarer og analysere dem for at vise, at vi kunne opnå det, vi ønskede. .
Proteinfordøjelse – også kendt som proteolyse eller hydrolyse
Proteiner er store molekyler, der består af individuelle 'byggesten' kaldet aminosyrer. Efter at have spist mad, der indeholder protein, begynder processen med proteolyse, da enzymer frigivet i forskellige dele af mave-tarmkanalen nedbryder det til aminosyrer og små peptider. Dette gør det muligt for disse byggesten at blive optaget i kroppen, hvor de kan rekombineres til at bygge nye proteiner (såsom muskler, hud, hår, antistoffer, enzymer, hormoner osv.).
Det er også muligt for proteinkilder at gennemgå en kontrolleret enzymatisk proteolyseproces som en del af deres forberedelse til inklusion i fremstillede fødevarer og ernæringsprodukter. For eksempel er proteinhydrolysater blevet brugt i årtier i human ernæring, især i produktionen af hypoallergene modermælkserstatninger til spædbørn/børn, der er allergiske over for komælksprotein.
Enzymatisk eller kemisk hydrolyse
Proteinhydrolyse – brydning af peptidbindinger, der forbinder aminosyrer gennem tilsætning af vand – kan opnås ved forskellige metoder: kemisk ved hjælp af syrer eller baser (alkaliske) eller enzymatisk (den tilgang, vi fokuserer på). Mens metoderne til syre og basisk hydrolyse af proteiner tilbyder fordelen ved lave omkostninger, er der negative konsekvenser med hensyn til den ernæringsmæssige kvalitet af de producerede hydrolysater. Syrehydrolyse resulterer i fuldstændig ødelæggelse af den essentielle aminosyre tryptofan, såvel som delvist tab af methionin, cystin og cystein (Pasupuleki & Braun, 2010). Tilsvarende resulterer alkalisk hydrolyse i fuldstændig ødelæggelse af de fleste aminosyrer, selvom tryptofan kan overleve intakt (Dai, et al., 2014), (Hou, et al., 2017).
Sammenlignet med sur og alkalisk hydrolyse er de vigtigste fordele ved enzymatisk hydrolyse af proteiner:
- Hydrolysebetingelserne såsom temperatur og pH er milde og resulterer ikke i noget kendt tab af aminosyrer.
- Anvendelsen af proteaseenzym(er) er mere specifik og præcis til at kontrollere omfanget af hydrolyse og størrelsen af peptider.
- De små mængder enzym, der bruges, kan let deaktiveres (f.eks. opvarmning til 80 – 85ºC i mindst 3 minutter) for at standse hydrolysereaktionen. (Hou, et al., 2017).
Ernæringsmæssige fordele ved enzymatisk hydrolyseret protein: proteinfordøjelighed og absorption.
Ud over den anvendte metode til proteinhydrolyse, som skitseret tidligere, afhænger ernæringsværdien af proteinhydrolysater af sammensætningen af frie aminosyrer, små peptider (typisk di- og tri-peptider) og store tilstedeværende peptider. Historisk har man troet, at kun frie aminosyrer blev absorberet fra mave-tarmkanalen af specifikke aminosyretransportører. Dette forekommer, men det er nu anerkendt, at størstedelen af aminosyrerne absorberes som di- og tri-peptider af den bredspecificerede peptidtransportør PepT1 (Fei, et al., 1994). PepT1 kan potentielt transportere alle 400 di-peptider og 8,000 tri-peptider, der er resultatet af at kombinere de 20 forskellige diætaminosyrer (Daniel, 2004). Derfor ville det forventes, at indtagelse af et proteinhydrolysat indeholdende høje andele af di- og tri-peptider ville lette proteinfordøjelse og -absorption, hvilket resulterer i øget fordøjelighed og aminosyrebiotilgængelighed.
Det er klart, at etablering af de bedste enzym- og hydrolysebetingelser er afgørende for at kunne skabe proteinhydrolysater med de ønskede endelige peptidstørrelsesprofiler. Peptidstørrelsesfordeling kan bestemmes ved hjælp af en teknik kaldet størrelsesudelukkelseskromatografi. Størrelseseksklusionskromatografi (SEC) er en analytisk kemiteknik, hvor blandinger af molekyler (såsom proteiner eller peptider) opløst i en opløsning adskilles efter deres størrelse (som skitseret i figur 1).
FIGUR 1. Enkel oversigt over adskillelse af molekyler af forskellig størrelse i en opløsning ved størrelsesudelukkelseskromatografi (SEC). Opløsningen påføres en søjle, som er pakket med en harpiks af porøse sfæriske perler (grå kugler). Store molekyler (røde cirkler) vil ikke være i stand til at trænge ind i perlernes porer (huller) og passerer derfor relativt hurtigt ned i søjlen og vil blive opdaget først. Mindre molekyler i prøven kan trænge ind i porerne i varierende grad afhængigt af deres størrelse. 'Mellemstore' molekyler (grønne cirkler) vil være i stand til at trænge ind i nogle perler, men ikke andre og vil derfor tage længere tid at passere gennem søjlen, mens de mindste molekyler (blå cirkler) vil være i stand til at trænge ind i alle porerne og vil tage den længste til at passere gennem søjlen.
Metoder
Råmateriale – Friske prøver af kyllingekroppe, andekroppe og laksestel blev størrelsesreduceret, homogeniseret til en tyk pasta og frosset. Frisk lammelever blev frosset hel. Materialerne blev sendt til Nofima, Ås, Norge, til proteolyse og analyse.
Proteolyse – For hvert råmateriale (kylling, and, laks og lam) blev en 500 g prøve blandet med 990 ml destilleret vand i en reaktionsbeholder af glas og omrørt ved 300 rpm. For hvert råmateriale blev tre forskellige proteaseenzymer testet ved to forskellige koncentrationer og to tidspunkter, hvilket resulterede i 48 hydrolysatprøver til analyse.
Størrelsesudelukkelseskromatografi – Molekylvægtfordelingen af den vandopløselige proteinfraktion af hydrolysaterne blev bestemt ved størrelsesudelukkelseskromatografi under anvendelse af et Shimadzu LC-20AT højtydende væskekromatografi (HPLC) system med en fotodiode array detektor (SPD M20A) indstillet til 214nm.
Kollagenpeptidindhold – Hydroxyprolin er en modificeret aminosyre, hvis tilstedeværelse hovedsageligt er begrænset til kollagen. Hydroxyprolinindholdet i proteinhydrolysater kan bruges som et indirekte mål for mængden af tilstedeværende kollagen/kollagenpeptider. En fuld aminosyreanalyse (inklusive hydroxyprolin) af hvert råmateriale blev udført af Nofima Biolab; desuden blev hydroxyprolinindholdet bestemt på et akkrediteret laboratorium (ALS, Norge) i den vandopløselige fraktion af hydrolysaterne.
Resultater
Peptidstørrelsesfordeling af hydrolysater – Generelt for hvert testet enzym resulterede inkubation af hvert råmateriale med den højere koncentration af enzym og i en længere varighed i et "gunstigt" skift i hydrolysaternes peptidstørrelsesprofil (dvs. en stigning i andelen af mindre peptider ). Dette er fremhævet i figur 2, som viser resultater for hvert råmateriale ved at bruge det 'bedste' enzym ved 'ikke-optimal' koncentration og varighed sammenlignet med 'optimal' koncentration og varighed. Med optimerede betingelser fandt vi, at 100 % af peptiderne var ≤3 kDa, og mere end 75 % var < 0.5 kDa (figur 2).
Baseret på det samlede bevis fra adskillige undersøgelser i en række arter (f.eks. rotter, gris, hund, mennesker; se (Zhangi & Matthews, 2010) for et overblik er det generelt godt accepteret, at:
- Absorption af peptider er bedre sammenlignet med intakt protein.
- Absorption af peptider er bedre end frie aminosyrer.
- Absorption af små peptider er bedre end af store peptider.
Fysiologisk optages størstedelen af aminosyrerne som små peptider bestående af 2 eller 3 aminosyrer, der er bundet sammen (henholdsvis di- og tri-peptider). Derfor ville det forventes, at indtagelse af et proteinhydrolysat indeholdende høje andele af di- og tri-peptider ville lette proteinfordøjelse og -absorption, hvilket resulterer i øget fordøjelighed og aminosyrebiotilgængelighed. Den gennemsnitlige molekylvægt af en aminosyre er 110 Daltons (Da), så di- og tri-peptider ville have en molekylvægt på ca. 220-330 Da (0.2-0.3 kDa). Vores resultater i at opnå proteinhydrolysater med mere end 75 % af peptider mindre end 0.5 kDa (dvs. op til ~ 5 aminosyrer) betyder, at proteinet i vores kibbler ville være meget fordøjeligt og let absorberes af kæledyrene, der spiser det. Det er planen at demonstrere dette gennem en fodringsundersøgelse i samarbejde med Fakultetet for Veterinærmedicin, Universitetet i Gent.
Hertil kommer, at opnåelse af 100 % af peptider på 3 kDa eller mindre mindsker risikoen for at udløse en allergisk reaktion på proteinkilderne og kan derfor betragtes som hypoallergen.
Figur 2.
Størrelsesfordeling (kDa) af peptider i vandfasen af hydrolysater af hvert råmateriale inkuberet med det samme enzym under 'ikke-optimerede' og 'optimerede' betingelser med hensyn til enzymkoncentration og varighed af hydrolysen. Bemærk især, hvordan procentdelen af peptider mellem 1.0-3.0 kDa falder, og peptider <0.5 kDa stiger, og går fra 'ikke-optimerede' til 'optimerede' betingelser.
Kollagenpeptidindhold
For hvert testet råmateriale klarede enzym A og C sig generelt 'bedre' (med hensyn til at genvinde en større procentdel af hydroxyprolin i vandfasen af hydrolysaterne) end enzym B, når man sammenligner en given varighed af hydrolyse og enzymkoncentration (se f.eks. resultater for laks i figur 3).
Da 'intakt' kollagenprotein ikke er opløseligt i vand, indikerer tilstedeværelsen af hydroxyprolin (vores markør for 'kollagen') i vandfasen, at kollagenproteinet er blevet fordøjet til kollagenpeptider (som er vandopløselige). Vores resultater illustrerer, at vi er i stand til at bruge enzymatisk proteolyse til at skabe råmaterialer, der er i stand til at bringe potentielle funktionelle fordele, såsom at understøtte ledsundhed, hudsundhed og tarmsundhed gennem de kollagenpeptider, der er til stede i dem.
FIGUR 3. Procentdel af hydroxyprolin (en aminosyre, der næsten udelukkende findes i kollagen), genvundet i vandfasen af hydrolyseret laks med tre forskellige enzymer (A, B eller C) inkuberet med råmaterialet (laks) i to forskellige koncentrationer (C1 eller C2) for to forskellige tidsperioder (T1 eller T2).
Konklusion
Disse positive resultater giver muligheder for at få ekstra værdi fra den naturlige tilstedeværelse af kollagen i visse råmaterialer ved at skabe kollagenpeptider med potentiale til at levere funktionelle fordele, såsom opretholdelse af sunde led hos aktive kæledyr og forbedring af leddenes mobilitet og fleksibilitet hos ældre kæledyr, f. eksempel.
Med den høje procentdel (>75%) af små peptider (<0.5kDa) produceret under 'optimerede' forhold baseret på denne forskning, er den første del af vores HDP målet er nået. Det næste vigtige skridt er at demonstrere, at kibble fremstillet med denne HDP faktisk er mere fordøjelig og biotilgængelig end vores eksisterende frisklavede produkter – vi har travlt med at udføre dette i en fodringsundersøgelse med University of Gent Dyrlægeskole. Hold øje med dette rum!
Referencer
- Cave, N., 2006. Hydrolyseret proteindiæt til hunde og katte. Dyrlægeklinikker Smådyrpraksis, bind 36, s. 1251-1268.
- Dai, Z., Wu, Z., Jia, S. & Wu, G., 2014. Analyse af aminosyresammensætning i proteiner i animalsk væv og fødevarer som præ-kolonne o-phthaldialdehyd-derivater ved HPLC med fluorescensdetektion. J Chromatography B, bind 964, s. 116-127.
- Daniel, H., 2004. Molecular and integrative physiology of intestinal peptide transport.. Annual Review of Physiology, bind 66, s. 361-384.
- Fei, Y. et al., 1994. Ekspressionskloning af en pattedyrs protonkoblet oligopeptidtransportør. Nature, bind 7, s. 563-566.
- Hanaoka, K. et al., 2019. Karakterisering af proteiner og peptiders molekylvægt under fremstilling af kæledyrsfoder. [Online] Tilgængelig på: https://www.diana-petfood.com/emea-en/publications/
- Hou, Y. et al., 2017. Proteinhydroysater i animalsk ernæring: Industriel produktion, bioaktive peptider og funktionel betydning. Journal of Animal Science and Biotechnology, s. 24-36.
- Knights, R., 1985. Bearbejdning og evaluering af proteinhydrolysater. I: Ernæring til særlige behov. New York: Marcel Dekker, s. 105-115.
- MINTEL, 2017. Større gennemsigtighed mht. protein i dyrefoder, sl: MINTEL RAPPORTER.
- Pasupuleki, VK, Braun, S, 2010. State of the art fremstilling af proteinhydrolysater. I: Protein Hydrolysates in Biotechnology. New York: Springer, s. 11-32.
- Zhangi, B. & Matthews, J., 2010. Fysiologisk betydning og mekanismer for proteinhydrolysatabsorption. I: Protein Hydrolysates in Biotechnology. New York: Springer, s. 135-177.