Vývoj přístupu k hydrolýze proteinů pro zvýšení nutričních přínosů čerstvě připraveného masa a ryb.
Vědecký podpůrný dokument Dr. Adriana Hewson-Hughese | Poradce pro výživu, bezpečnost potravin a inovace, GA Pet Food Partners.
Úvod.
Obsah živočišných bílkovin je dobře zavedený jako základ vysoce kvalitních krmiv pro psy a kočky a mnoho majitelů domácích zvířat uznává, že zde platí pravidlo „kvalita před kvantitou“. Podle průzkumu trhu společnosti Mintel 59 % majitelů koček a 57 % majitelů psů tvrdí, že kvalita masa je důležitější než celkový obsah masa v krmivu pro domácí zvířata. (MINTEL, 2017).
GA Pet Food Partners to už dávno uznává. Od zavedení Freshtrusion®, GA je průkopníkem ve vývoji a výrobě diet obsahujících rostoucí množství čerstvě připravených zdrojů bílkovin z masa a ryb. Výhody použití čerstvých zdrojů masa a ryb před sušenými, tavenými masovými a rybími pokrmy, včetně lepší chuti a zvýšené stravitelnosti, jsou dobře oceněny jak domácími mazlíčky, tak jejich majiteli.
Snažíme se našim partnerům nabízet ještě lepší produkty.
Trh s krmivy pro domácí mazlíčky je velmi dynamický a i když je zdůrazňování přesného vysokého podílu masa/ryb/drůbeže ve výrobcích moudrým krokem, stává se to spíše základním očekáváním než požadovanou kvalitou u těchto produktů majitelů domácích mazlíčků. Zde v GA neustále usilujeme o způsoby, jak nabídnout Partners ještě lepší produkty, a proto jsme se rozhodli udělat zdánlivě nemožné – přijít na způsob, jak vařit naše čerstvé maso a rybí suroviny, aby byly ještě lepší pro domácí mazlíčky .
Cílem je zvýšit nutriční hodnotu proteinu v našich čerstvých masových a rybích ingrediencích přeměnou proteinu na malé peptidy, které jsou snadněji absorbovány zvířaty, které je konzumují (říkáme tomu „HDP“ – vysoce stravitelný protein). Aby nám pomohli v tomto hledání, identifikovali jsme odborníky z Nofima, předního výzkumného institutu pro aplikovaný výzkum potravin se sídlem v Norsku, aby optimalizovali podmínky pro enzymatické trávení vybraných masných a rybích surovin a analyzovali je, abychom prokázali, že můžeme dosáhnout toho, co jsme chtěli. .
Trávení bílkovin – aka proteolýza nebo hydrolýza
Proteiny jsou velké molekuly složené z jednotlivých „stavebních bloků“ nazývaných aminokyseliny. Po konzumaci jídla obsahujícího protein začíná proces proteolýzy, protože enzymy uvolňované v různých částech gastrointestinálního traktu je rozkládají na aminokyseliny a malé peptidy. To umožňuje vstřebání těchto stavebních bloků do těla, kde mohou být rekombinovány za účelem vytvoření nových proteinů (jako jsou svaly, kůže, vlasy, protilátky, enzymy, hormony atd.).
Je také možné, aby zdroje bílkovin podstoupily proces řízené enzymatické proteolýzy jako součást jejich přípravy pro zahrnutí do vyráběných potravin a nutričních produktů. Například proteinové hydrolyzáty se po desetiletí používají v lidské výživě, zejména při výrobě hypoalergenních kojeneckých mléčných výživ pro kojence/děti alergické na bílkovinu kravského mléka.
Enzymatická nebo chemická hydrolýza
Hydrolýzu bílkovin – rozbití peptidových vazeb, které spojují aminokyseliny dohromady přidáním vody – lze dosáhnout různými metodami: chemicky pomocí kyselin nebo zásad (alkalické) nebo enzymaticky (přístup, na který se zaměřujeme). Zatímco metody kyselé a alkalické hydrolýzy proteinů nabízejí výhodu nízké ceny, mají negativní důsledky z hlediska nutriční kvality produkovaných hydrolyzátů. Kyselá hydrolýza vede k úplné destrukci esenciální aminokyseliny tryptofanu a také k částečné ztrátě methioninu, cystinu a cysteinu. (Pasupuleki & Braun, 2010). Podobně alkalická hydrolýza vede k úplné destrukci většiny aminokyselin, i když tryptofan může přežít neporušený (Dai, et al., 2014) (Hou, et al., 2017).
Ve srovnání s kyselou a alkalickou hydrolýzou jsou hlavní výhody enzymatické hydrolýzy bílkovin:
- Podmínky hydrolýzy, jako je teplota a pH, jsou mírné a nevedou k žádné známé ztrátě aminokyselin.
- Použití enzymu (enzymů) proteázy je specifičtější a přesnější při kontrole rozsahu hydrolýzy a velikosti peptidů.
- Malé množství použitého enzymu lze snadno deaktivovat (např. zahřátím na 80 – 85ºC po dobu alespoň 3 minut), aby se zastavila hydrolytická reakce. (Hou, et al., 2017).
Nutriční výhody enzymaticky hydrolyzovaného proteinu: stravitelnost a vstřebatelnost proteinu.
Kromě použité metody hydrolýzy proteinů, jak bylo uvedeno výše, závisí nutriční hodnota proteinových hydrolyzátů na složení volných aminokyselin, malých peptidů (typicky di- a tri-peptidů) a velkých peptidů přítomných. Historicky se věřilo, že pouze volné aminokyseliny byly absorbovány z gastrointestinálního traktu specifickými přenašeči aminokyselin. K tomu skutečně dochází, ale nyní se uznává, že většina aminokyselin je absorbována jako di- a tripeptidy širokospecifickým peptidovým transportérem PepT1. (Fei, et al., 1994). PepT1 může potenciálně transportovat všech 400 dipeptidů a 8,000 20 tripeptidů, které jsou výsledkem kombinace XNUMX různých dietních aminokyselin. (Daniel, 2004). Proto by se dalo očekávat, že požití proteinového hydrolyzátu obsahujícího vysoké podíly di- a tri-peptidů usnadní trávení a absorpci proteinu, což povede ke zvýšené stravitelnosti a biologické dostupnosti aminokyselin.
Je zřejmé, že stanovení nejlepších podmínek pro enzym a hydrolýzu je kritické, aby bylo možné vytvořit hydrolyzáty proteinů s požadovanými profily konečné velikosti peptidu. Distribuci velikosti peptidů lze určit pomocí techniky nazývané vylučovací chromatografie. Velikostní vylučovací chromatografie (SEC) je analytická chemická technika, při které se směsi molekul (jako jsou proteiny nebo peptidy) rozpuštěné v roztoku oddělují podle jejich velikosti (jak je uvedeno na obrázku 1).
OBRÁZEK 1. Jednoduchý přehled separace molekul různých velikostí v roztoku vylučovací chromatografií (SEC). Roztok se nanese na kolonu, která je naplněna pryskyřicí z porézních sférických kuliček (šedých kuliček). Velké molekuly (červená kolečka) nebudou moci vstoupit do pórů (otvorů) kuliček, a proto projdou sloupcem poměrně rychle a budou detekovány jako první. Menší molekuly ve vzorku mohou vstupovat do pórů v různé míře v závislosti na jejich velikosti. „Středně velké“ molekuly (zelené kroužky) budou moci vstoupit do některých kuliček, ale ne do jiných, a tak jim bude trvat déle, než projdou sloupcem, zatímco nejmenší molekuly (modré kroužky) budou moci vstoupit do všech pórů a budou trvat déle. nejdelší projet kolonou.
Metody
suroviny – Čerstvé vzorky kostry kuřete, kostry kachny a rámů lososa byly zmenšeny, homogenizovány do husté pasty a zmraženy. Čerstvá jehněčí játra byla zmražena celá. Materiály byly zaslány na Nofima, Ås, Norsko, pro proteolýzu a analýzu.
Proteolýza – Pro každou surovinu (kuře, kachna, losos a jehněčí) byl 500 g vzorek smíchán s 990 ml destilované vody ve skleněné reakční nádobě a míchán při 300 ot./min. Pro každou surovinu byly testovány tři různé proteázové enzymy ve dvou různých koncentracích a dvou časových bodech, což vedlo k analýze 48 vzorků hydrolyzátu.
Vylučovací chromatografie – Distribuce molekulové hmotnosti ve vodě rozpustné proteinové frakce hydrolyzátů byla stanovena vylučovací chromatografií pomocí systému Shimadzu LC-20AT vysoce výkonné kapalinové chromatografie (HPLC) s detektorem fotodiodového pole (SPD M20A) nastaveným na 214 nm.
Obsah kolagenových peptidů – Hydroxyprolin je modifikovaná aminokyselina, jejíž přítomnost je omezena především na kolagen. Obsah hydroxyprolinu v proteinových hydrolyzátech může být použit jako nepřímá míra množství přítomných kolagenových/kolagenových peptidů. Kompletní analýza aminokyselin (včetně hydroxyprolinu) každého surového materiálu byla provedena společností Nofima Biolab; kromě toho byl v akreditované laboratoři (ALS, Norsko) stanoven obsah hydroxyprolinu ve vodě rozpustné frakci hydrolyzátů.
výsledky
Distribuce velikosti peptidů hydrolyzátů – Obecně platí, že pro každý testovaný enzym vedla inkubace každé suroviny s vyšší koncentrací enzymu a po delší dobu k „příznivému“ posunu v profilu velikosti peptidu hydrolyzátů (tj. zvýšení podílu menších peptidů ). To je zvýrazněno na obrázku 2, který ukazuje výsledky pro každou surovinu s použitím „nejlepšího“ enzymu při „neoptimální“ koncentraci a trvání ve srovnání s „optimální“ koncentrací a dobou trvání. S optimalizovanými podmínkami jsme zjistili, že 100 % peptidů bylo < 3 kDa a více než 75 % bylo < 0.5 kDa (obrázek 2).
Na základě souhrnných důkazů několika studií na řadě druhů (např. potkan, prase, pes, člověk; viz (Zhangi & Matthews, 2010) pro přehled je obecně dobře přijímáno, že:
- Absorpce peptidů je lepší ve srovnání s intaktní bílkovinou.
- Absorpce peptidů je lepší než volných aminokyselin.
- Absorpce malých peptidů je lepší než velkých peptidů.
Fyziologicky je většina aminokyselin absorbována jako malé peptidy skládající se ze 2 nebo 3 aminokyselin spojených dohromady (di- a tri-peptidy). Proto by se dalo očekávat, že požití proteinového hydrolyzátu obsahujícího vysoké podíly di- a tri-peptidů usnadní trávení a absorpci proteinu, což povede ke zvýšené stravitelnosti a biologické dostupnosti aminokyselin. Průměrná molekulová hmotnost aminokyseliny je 110 Daltonů (Da), takže di- a tripeptidy by měly molekulovou hmotnost přibližně 220-330 Da (0.2-0.3 kDa). Naše výsledky při dosahování proteinových hydrolyzátů s více než 75 % peptidů menších než 0.5 kDa (tj. až ~ 5 aminokyselin) znamenají, že protein v našich granulích bude vysoce stravitelný a snadno vstřebatelný pro domácí mazlíčky, kteří je konzumují. Plánuje se to prokázat prostřednictvím studie krmení ve spolupráci s Fakultou veterinárního lékařství Univerzity v Gentu.
Dosažení 100 % peptidů o velikosti 3 kDa nebo menší navíc snižuje riziko vyvolání alergické reakce na zdroje bílkovin, a lze je tedy považovat za hypoalergenní.
Obrázek 2.
Distribuce velikosti (kDa) peptidů ve vodní fázi hydrolyzátů každé suroviny inkubované se stejným enzymem za „neoptimalizovaných“ a „optimalizovaných“ podmínek z hlediska koncentrace enzymu a trvání hydrolýzy. Všimněte si zejména toho, jak se procento peptidů mezi 1.0-3.0 kDa snižuje a peptidy <0.5 kDa zvyšuje, přičemž se pohybuje od „neoptimalizovaných“ k „optimalizovaným“ podmínkám.
Obsah kolagenových peptidů
U každé testované suroviny si enzymy A a C vedly obecně „lépe“ (ve smyslu regenerace většího procenta hydroxyprolinu ve vodné fázi hydrolyzátů) než enzym B při srovnání dané doby trvání hydrolýzy a koncentrace enzymu (např. viz. výsledky pro lososa na obrázku 3).
Protože „neporušený“ kolagenový protein není rozpustný ve vodě, přítomnost hydroxyprolinu (náš marker „kolagenu“) ve vodní fázi naznačuje, že kolagenový protein byl štěpen na kolagenní peptidy (které jsou rozpustné ve vodě). Naše výsledky ilustrují, že jsme schopni využít enzymatickou proteolýzu k vytvoření surovin, které jsou schopny přinést potenciální funkční výhody, jako je podpora zdraví kloubů, zdraví kůže a zdraví střev prostřednictvím kolagenových peptidů v nich přítomných.
OBRÁZEK 3. Procento hydroxyprolinu (aminokyselina nacházející se téměř výhradně v kolagenu) získaného ve vodní fázi hydrolyzovaného lososa pomocí tří různých enzymů (A, B nebo C) inkubovaných se surovinou (lososem) ve dvou různých koncentracích (C1 nebo C2) pro dvě různá časová období (T1 nebo T2).
Proč investovat do čističky vzduchu?
Tyto pozitivní výsledky představují příležitosti k získání extra hodnoty z přirozené přítomnosti kolagenu v určitých surovinách vytvořením kolagenových peptidů s potenciálem poskytovat funkční výhody, jako je udržení zdravých kloubů u aktivních zvířat a zlepšení mobility a flexibility kloubů u starších zvířat. příklad.
S vysokým procentem (>75 %) malých peptidů (<0.5 kDa) vyrobených za „optimalizovaných“ podmínek na základě tohoto výzkumu, první část našeho HDP cíl je dosažen. Dalším důležitým krokem je prokázat, že granule vyrobené z tohoto HDP jsou skutečně stravitelnější a biologicky dostupnější než naše stávající čerstvě připravené produkty – jsme zaneprázdněni tím, abychom to provedli ve studii krmení s Univerzita v Gentu Veterinární škola. Sledujte tento prostor!
Reference
- Cave, N., 2006. Hydrolyzované proteinové diety pro psy a kočky. Veterinární kliniky Praxe malých zvířat, svazek 36, s. 1251-1268.
- Dai, Z., Wu, Z., Jia, S. & Wu, G., 2014. Analýza složení aminokyselin v proteinech živočišných tkání a potravin jako předkolonové deriváty o-ftaldialdehydu pomocí HPLC s fluorescenční detekcí.. J Chromatografie B, svazek 964, s. 116-127.
- Daniel, H., 2004. Molekulární a integrativní fyziologie transportu intestinálních peptidů. Annual Review of Physiology, Volume 66, str. 361-384.
- Fei, Y. a kol., 1994. Expresní klonování savčího protonově spřaženého oligopeptidového transportéru. Nature, svazek 7, str. 563-566.
- Hanaoka, K. et al., 2019. Charakterizace molekulové hmotnosti proteinů a peptidů při výrobě potravin pro domácí mazlíčky. [Online] Dostupné na: https://www.diana-petfood.com/emea-en/publications/
- Hou, Y. et al., 2017. Proteinové hydrolyzáty ve výživě zvířat: Průmyslová výroba, bioaktivní peptidy a funkční význam. Journal of Animal Science and Biotechnology, s. 24-36.
- Knights, R., 1985. Zpracování a hodnocení proteinových hydrolyzátů. In: Výživa pro speciální potřeby. New York: Marcel Dekker, s. 105-115.
- MINTEL, 2017. Větší transparentnost, pokud jde o bílkoviny v krmivu pro domácí zvířata, sl: MINTEL REPORTS.
- Pasupuleki, VK, Braun, S, 2010. Nejmodernější výroba proteinových hydrolyzátů. In: Proteinové hydrolyzáty v biotechnologii. New York: Springer, s. 11-32.
- Zhangi, B. & Matthews, J., 2010. Fyziologický význam a mechanismy absorpce proteinového hydrolyzátu. In: Proteinové hydrolyzáty v biotechnologii. New York: Springer, s. 135-177.