Разработване на подход за хидролиза на протеини за увеличаване на хранителните ползи от прясно приготвено месо и риба.
Документ за научна помощ от д-р Адриан Хюсън-Хюз | Съветник по хранене, безопасност на храните и иновации, GA Pet Food Partners.
Въведение.
Съдържанието на животински протеин е добре установено като същността на висококачествените храни за кучета и котки и много собственици на домашни любимци признават, че тук важи поговорката „качество пред количество“. Според компанията за пазарни проучвания Mintel, 59% от собствениците на котки и 57% от собствениците на кучета казват, че качеството на месото е по-важно от общото съдържание на месо в храната за домашни любимци (MINTEL, 2017).
GA Pet Food Partners отдавна е осъзнал това. От въвеждането на Freshtrusion®, GA поведе пътя в разработването и производството на диети, съдържащи нарастващи количества източници на прясно приготвено месо и риба. Ползите от използването на прясно месо и рибни източници пред сушени, топени месни и рибни ястия, включително по-добър вкус и повишена смилаемост, се оценяват добре както от домашните любимци, така и от техните собственици.
Стремейки се да предложим на нашите партньори още по-добри продукти.
Пазарът на храни за домашни любимци е много динамичен и докато подчертаването на точния висок дял на месо/риба/птиче в продуктите е мъдър ход, това се превръща в основно очакване, а не в желаното качество за тези продукти от собствениците на домашни любимци. Тук, в GA, ние непрекъснато се стремим да намерим начини да предложим на партньорите още по-добри продукти и затова се заехме да направим привидно невъзможното – да измислим начин да готвим нашите пресни месни и рибни съставки, за да ги направим още по-добри за домашни любимци .
Идеята е да се увеличи хранителната стойност на протеина в нашите съставки от прясно месо и риба чрез превръщане на протеина в малки пептиди, които се усвояват по-лесно от домашните любимци, които го ядат (ние го наричаме „HDP“ – високосмилаем протеин). За да ни помогне в това търсене, ние идентифицирахме експерти от Nofima, водещ изследователски институт за приложни изследвания на храните, базиран в Норвегия, за оптимизиране на условията за ензимно смилане на избрани месни и рибни суровини и да ги анализират, за да демонстрират, че можем да постигнем това, което искахме .
Смилане на протеини – още известно като протеолиза или хидролиза
Протеините са големи молекули, съставени от отделни „градивни елементи“, наречени аминокиселини. След ядене на храна, съдържаща протеин, процесът на протеолиза започва, тъй като ензимите, освободени в различни части на стомашно-чревния тракт, го разграждат на аминокиселини и малки пептиди. Това позволява тези градивни елементи да бъдат абсорбирани в тялото, където те могат да бъдат рекомбинирани за изграждане на нови протеини (като мускули, кожа, коса, антитела, ензими, хормони и др.).
Също така е възможно източниците на протеини да преминат през контролиран процес на ензимна протеолиза като част от подготовката им за включване в произведени храни и хранителни продукти. Например протеиновите хидролизати се използват от десетилетия в храненето на хората, най-вече в производството на хипоалергенни млечни формули за бебета/деца, алергични към протеина на кравето мляко.
Ензимна или химична хидролиза
Протеинова хидролиза – разкъсването на пептидни връзки, които свързват аминокиселините заедно чрез добавяне на вода – може да се постигне чрез различни методи: химически с помощта на киселини или основи (алкални) или ензимно (подходът, върху който се фокусираме). Докато методите на киселинна и алкална хидролиза на протеини предлагат предимството на ниската цена, има отрицателни последици по отношение на хранителното качество на произведените хидролизати. Киселинната хидролиза води до пълно разрушаване на незаменимата аминокиселина триптофан, както и частична загуба на метионин, цистин и цистеин (Пасупулеки и Браун, 2010). По подобен начин алкалната хидролиза води до пълното унищожаване на повечето аминокиселини, въпреки че триптофанът може да оцелее непокътнат (Дай, и др., 2014), (Хау, и др., 2017).
В сравнение с киселинната и алкалната хидролиза, основните предимства на ензимната хидролиза на протеини са:
- Условията на хидролиза като температура и pH са меки и не водят до известна загуба на аминокиселини.
- Използването на протеазен ензим(и) е по-специфично и прецизно при контролиране на степента на хидролиза и размера на пептидите.
- Малките количества от използвания ензим могат лесно да бъдат деактивирани (напр. нагряване до 80 – 85ºC за поне 3 минути), за да се спре реакцията на хидролиза. (Хау, и др., 2017).
Хранителни предимства на ензимно хидролизирания протеин: смилаемост и усвояване на протеина.
В допълнение към използвания метод на протеинова хидролиза, както беше описано по-горе, хранителната стойност на протеиновите хидролизати зависи от състава на наличните свободни аминокиселини, малки пептиди (обикновено ди- и три-пептиди) и големи пептиди. Исторически се е смятало, че само свободни аминокиселини се абсорбират от стомашно-чревния тракт от специфични транспортери на аминокиселини. Това се случва, но сега се признава, че по-голямата част от аминокиселините се абсорбират като ди- и три-пептиди от широкоспецифичния пептиден транспортер PepT1 (Фей, и др., 1994). PepT1 може потенциално да транспортира всичките 400 ди-пептида и 8,000 три-пептида, които са резултат от комбинирането на 20-те различни хранителни аминокиселини (Даниел, 2004). Следователно би могло да се очаква, че поглъщането на протеинов хидролизат, съдържащ високи пропорции на ди- и три-пептиди, ще улесни смилането и усвояването на протеина, което води до повишена смилаемост и бионаличност на аминокиселини.
Ясно е, че установяването на най-добрите условия за ензим и хидролиза е от решаващо значение, за да можете да създадете протеинови хидролизати с желаните крайни профили на размера на пептида. Разпределението на размера на пептида може да се определи с помощта на техника, наречена хроматография с изключване на размера. Хроматографията с изключване по размер (SEC) е техника на аналитична химия, при която смеси от молекули (като протеини или пептиди), разтворени в разтвор, се разделят по техния размер (както е показано на фигура 1).
ФИГУРА 1. Опростен преглед на разделянето на молекули с различни размери в разтвор чрез хроматография с изключване по размер (SEC). Разтворът се нанася върху колона, която е пълна със смола от порести сферични перли (сиви сфери). Големите молекули (червени кръгове) няма да могат да влязат в порите (дупките) на перлите и следователно преминават по колоната относително бързо и ще бъдат открити първи. По-малките молекули в пробата могат да навлязат в порите в различна степен в зависимост от техния размер. Молекулите със среден размер (зелени кръгове) ще могат да влязат в някои перли, но не и в други и така ще отнеме повече време, за да преминат през колоната, докато най-малките молекули (сините кръгове) ще могат да влязат във всички пори и ще отнемат най-дълго преминава през колоната.
Методи
Сурови материали – Пресни проби от пилешки труп, патешки труп и рамки от сьомга бяха намалени по размер, хомогенизирани в гъста паста и замразени. Пресният агнешки дроб беше замразен цял. Материалите са изпратени на Нофима, Ås, Норвегия, за протеолиза и анализ.
Протеолиза – За всяка суровина (пиле, патица, сьомга и агнешко) проба от 500 g се смесва с 990 ml дестилирана вода в стъклен реакционен съд и се разбърква при 300 rpm. За всяка суровина бяха тествани три различни протеазни ензима при две различни концентрации и две времеви точки, което доведе до 48 проби от хидролизат за анализ.
Хроматография с изключване по размер – Разпределението на молекулното тегло на водоразтворимата протеинова фракция на хидролизатите се определя чрез хроматография с изключване по размер, като се използва система за високоефективна течна хроматография Shimadzu LC-20AT (HPLC) с фотодиоден детектор (SPD M20A), настроен на 214 nm.
Съдържание на колагенов пептид – Хидроксипролинът е модифицирана аминокиселина, чието присъствие се ограничава главно до колагена. Съдържанието на хидроксипролин в протеиновите хидролизати може да се използва като индиректна мярка за количеството колаген/колагенови пептиди. Пълен аминокиселинен анализ (включително хидроксипролин) на всяка суровина беше извършен от Nofima Biolab; в допълнение, съдържанието на хидроксипролин беше определено в акредитирана лаборатория (ALS, Норвегия) във водоразтворимата фракция на хидролизатите.
Резултати
Разпределение на хидролизатите по размер на пептида – Като цяло, за всеки тестван ензим, инкубацията на всяка суровина с по-висока концентрация на ензим и за по-дълъг период от време води до „полезна“ промяна в профила на пептидния размер на хидролизатите (т.е. увеличаване на дела на по-малките пептиди ). Това е подчертано на Фигура 2, която показва резултатите за всяка суровина, използвайки „най-добрия“ ензим при „неоптимална“ концентрация и продължителност в сравнение с „оптималната“ концентрация и продължителност. С оптимизирани условия открихме, че 100% от пептидите са ≤3 kDa, а повече от 75% са <0.5 kDa (Фигура 2).
Въз основа на колективните доказателства от няколко проучвания върху редица видове (напр. плъх, прасе, куче, човек; вж. (Zhangi & Matthews, 2010) за общ преглед, обикновено се приема, че:
- Усвояването на пептидите е по-добро в сравнение с непокътнатия протеин.
- Усвояването на пептидите е по-добро от свободните аминокиселини.
- Усвояването на малките пептиди е по-добро от това на големите пептиди.
Физиологично по-голямата част от аминокиселините се абсорбират като малки пептиди, състоящи се от 2 или 3 аминокиселини, свързани заедно (ди- и три-пептиди, съответно). Следователно би могло да се очаква, че поглъщането на протеинов хидролизат, съдържащ високи пропорции на ди- и три-пептиди, ще улесни смилането и усвояването на протеина, което води до повишена смилаемост и бионаличност на аминокиселини. Средното молекулно тегло на една аминокиселина е 110 далтона (Da), така че ди- и три-пептидите биха имали молекулно тегло приблизително 220-330 Da (0.2-0.3 kDa). Нашите резултати при постигане на протеинови хидролизати с повече от 75% пептиди по-малки от 0.5 kDa (т.е. до ~ 5 аминокиселини) означават, че протеинът в нашите гранули ще бъде много смилаем и лесно усвоим от домашните любимци, които го ядат. Планира се да се демонстрира това чрез изследване на храненето в сътрудничество с Факултета по ветеринарна медицина на Университета в Гент.
В допълнение, постигането на 100% пептиди от 3 kDa или по-малки намалява риска от предизвикване на алергична реакция към източниците на протеини и следователно може да се счита за хипоалергичен.
Фигура 2.
Разпределение на размера (kDa) на пептидите във водната фаза на хидролизатите на всяка суровина, инкубирана със същия ензим при „неоптимизирани“ и „оптимизирани“ условия по отношение на концентрацията на ензима и продължителността на хидролизата. Обърнете внимание по-специално как процентът на пептидите между 1.0-3.0 kDa намалява и пептидите <0.5 kDa се увеличава, преминавайки от „неоптимизирани“ към „оптимизирани“ условия.
Съдържание на колагенов пептид
За всяка изследвана суровина ензимите А и С се представят като цяло „по-добре“ (от гледна точка на възстановяване на по-голям процент хидроксипролин във водната фаза на хидролизатите) от ензим В при сравняване на дадена продължителност на хидролиза и концентрация на ензима (напр. вж. резултати за сьомга на фигура 3).
Тъй като „интактният“ колагенов протеин не е разтворим във вода, наличието на хидроксипролин (нашият маркер за „колаген“) във водната фаза показва, че колагеновият протеин е усвоен в колагенови пептиди (които са водоразтворими). Нашите резултати показват, че можем да използваме ензимна протеолиза, за да създадем суровини, които са в състояние да донесат потенциални функционални ползи като поддържане на здравето на ставите, здравето на кожата и здравето на червата чрез присъстващите в тях колагенови пептиди.
ФИГУРА 3. Процент хидроксипролин (аминокиселина, открита почти изключително в колагена), възстановен във водната фаза на хидролизирана сьомга с три различни ензима (A, B или C), инкубиран със суровината (сьомга) при две различни концентрации (C1 или C2) за два различни периода от време (T1 или T2).
Заключение
Тези положителни резултати предоставят възможности за получаване на допълнителна стойност от естественото присъствие на колаген в определени суровини чрез създаване на колагенови пептиди с потенциал за осигуряване на функционални ползи като поддържане на здрави стави при активни домашни любимци и подобряване на подвижността и гъвкавостта на ставите при по-възрастни домашни любимци, за пример.
С високия процент (>75%) малки пептиди (<0.5 kDa), произведени при „оптимизирани“ условия въз основа на това изследване, първата част от нашата HDP целта е постигната. Следващата важна стъпка е да демонстрираме, че гранулите, направени с този HDP, наистина са по-смилаеми и биодостъпни от нашите съществуващи прясно приготвени продукти – ние сме заети да извършваме това в проучване за хранене с Университет в Гент Ветеринарно училище. Гледайте това пространство!
Препратки
- Cave, N., 2006. Хидролизирани протеинови диети за кучета и котки. Практика за малки животни във ветеринарни клиники, том 36, стр. 1251-1268.
- Dai, Z., Wu, Z., Jia, S. & Wu, G., 2014. Анализ на аминокиселинния състав в протеини от животински тъкани и храни като производни на о-фталдиалдехид преди колона чрез HPLC с флуоресцентно откриване.. J Хроматография В, том 964, стр. 116-127.
- Daniel, H., 2004. Молекулярна и интегративна физиология на чревния пептиден транспорт. Годишен преглед на физиологията, том 66, стр. 361-384.
- Fei, Y. et al., 1994. Експресионно клониране на протон-свързан олигопептиден транспортер на бозайник. Nature, Том 7, стр. 563-566.
- Hanaoka, K. et al., 2019. Характеризиране на молекулното тегло на протеини и пептиди по време на производството на вкусови храни за домашни любимци. [Онлайн] Налично на: https://www.diana-petfood.com/emea-en/publications/
- Hou, Y. et al., 2017. Протеинови хидролизати в храненето на животните: промишлено производство, биоактивни пептиди и функционално значение. Journal of Animal Science and Biotechnology, стр. 24-36.
- Knights, R., 1985. Обработка и оценка на протеинови хидролизати. В: Хранене за специални нужди. Ню Йорк: Marcel Dekker, стр. 105-115.
- MINTEL, 2017. По-голяма прозрачност по отношение на протеините в храните за домашни любимци, sl: MINTEL REPORTS.
- Pasupuleki, VK, Braun, S, 2010. Най-съвременно производство на протеинови хидролизати. В: Протеинови хидролизати в биотехнологиите. Ню Йорк: Springer, стр. 11-32.
- Zhangi, B. & Matthews, J., 2010. Физиологично значение и механизми на абсорбция на протеинов хидролизат. В: Протеинови хидролизати в биотехнологиите. Ню Йорк: Springer, стр. 135-177.